甘草養陰湯對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖和凋亡的影響*

陳永，邱富娟，陳艷娟，朱興旺，劉永譜，余焙佳，肖長虹

1.南方醫科大學中西醫結合醫院，廣東 廣州 510330； 2.暨南大學，廣東 廣州 510632

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是最常見的風濕科疾病，患病率高達0.5%～1.0%[1]。RA危害極大，其突出的病理特點是滑膜增生并侵蝕關節軟骨和骨質，最終導致關節破壞甚至畸形[2]，臨床表現為關節疼痛、變形和功能喪失，甚至累及人體多個系統、器官，引發并發間質性肺病、動脈粥樣硬化心血管病、貧血等[3]。

研究表明，滑膜成纖維細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)是RA發病進程中關鍵的效應細胞[4]。RA患者的滑膜從靜止的相對無細胞的結構轉變為充滿免疫細胞的增生性浸潤組織。活化的FLS迅速增殖形成血管翳[5]，并且能抑制細胞凋亡，FLS通過產生炎癥性細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、趨化因子和基質降解分子等增強遷移能力，加速關節軟骨的侵襲和破壞[6]。

目前RA的治療藥物包括糖皮質激素、改善風濕病情藥物及生物制劑等[7]。近幾十年來，RA病情控制雖然有了較大的提高，但仍存在難治性病例、耐藥、藥物副作用等挑戰[8]。甘草養陰湯是張仲景《金匱要略》中“甘草瀉心湯”改良而成的藥食同源配方。原甘草瀉心湯在白塞病(中醫“狐惑病”)中研究廣泛[9]，亦有對于RA等自身免疫性疾病的報道[10]，但原方中半夏具有小毒，黃連口感過于苦，改良后含有甘草、人參、羅漢果、蒲公英等藥物，這些藥物均出自國家衛計委公布的既是食品又是藥品的中藥名單[11]，配伍陰陽平和、滋陰扶陽。國內外大量研究證實，甘草[12]、人參[13]、蒲公英[14]等均具有抗炎、抗氧化、甚至抑制癌細胞增殖的作用，而RA-FLS分泌炎癥因子并具有侵襲性被認為具有癌細胞的特性[15]，推測甘草養陰湯可能對RA-FLS的增殖有一定影響。基于此，本研究通過體外實驗觀察甘草養陰湯對RA-FLS細胞增殖及凋亡的影響，為甘草養陰湯治療RA提供參考。

1 材料

1.1 動物SPF級雌性SD大鼠20只，6周齡，體質量180～220 g，購自南方醫科大學動物實驗中心，生產許可證號：SCXK(粵)2016-0041。溫度22～24 ℃，濕度30～60%條件飼養，自由飲食。

1.2 藥品與試劑甘草養陰湯(自備，專利號：201910843519.9)。1640培養基(美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：31870082)；胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液(美國ThermoFisher公司，貨號：10099、SV30010)；膠原酶、磷酸緩沖鹽溶液、D-Hanks液、胰酶(美國Sigma-Aldrich公司，貨號：C2674、D8537、H6648、R001100)；舒泰50(法國Virbac公司，規格：50 mg，批號：86ZBA)；MTT細胞增殖分析檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒(上海碧云天公司，貨號：C0009、C1062S、C1052)。

1.3 儀器3311型培養箱、ST40型離心機、51119600C型全波長酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；FACS Canto II流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)；DW-FL450型冰箱(長虹美菱股份有限公司)。

2 方法

2.1 FLS細胞分離和培養通過關節鏡滑膜切除術獲得3例RA患者的滑膜組織標本。患者均為女性，診斷符合1987年美國風濕病協會(American college of rheumatology，ACR)分類診斷標準[16]，已排除感染、結核、腫瘤、糖尿病及其他免疫相關疾病。患者被安排用于治療目的的膝關節內窺鏡手術，并書面同意捐贈滑膜組織用于研究。

無菌條件下剪碎滑膜組織，加入含質量濃度為4.0 g·L-1膠原酶的1640 培養基7 mL，于37 ℃、5%CO2培養箱孵育消化4 h，300×g離心5 min，收集細胞，加入含10%胎牛血清及10 g·L-1青霉素-鏈霉素雙抗的1640培養基，于37 ℃、5%CO2孵育箱中繼續培養，18 h后細胞貼壁。PBS洗滌，棄除未貼壁細胞，繼續培養18 h。貼壁細胞用D-Hanks液徹底沖洗后，用2.5 kg·L-1胰酶消化液消化，收集貼壁細胞，經流式細胞儀鑒定FLS純度達98%以上。FLS在含10%胎牛血清的培養基中培養，傳4～7代的細胞用于實驗研究。

2.2 含藥血清的制備將大鼠隨機分為2組，即生理鹽水對照組(normal saline，NS)和甘草養陰湯實驗組(gancao nurish Yin decortion，GC)，每組10只。GC組采用甘草養陰湯灌胃[用量：3.78 g(飲片當量)/kg(大鼠體質量)，相當于60 kg成人用量的6.3倍]，每日2次，連續灌胃7 d，NS組采用等量生理鹽水灌胃。灌胃完成2 h后，舒泰50肌肉注射進行麻醉，腹主動脈采血。4 ℃冰箱靜置1 h，300×g離心8 min分離血清，56 ℃水浴30 min滅活并過濾除菌后，加入終濃度為10 g·L-1青霉素-鏈霉素雙抗，分裝入離心管，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

2.3 細胞增殖實驗收集對數期FLS，調整細胞懸液濃度為1×106mL-1，96孔板中每孔加入100 μL，37 ℃、5%CO2培養箱孵育18 h后細胞貼壁，棄上清。NS組加入100 μL含10%NS組大鼠血清的1640 培養基，GC組加入100 μL含10%GC組大鼠血清的1640培養基，分別于培養0 h、24 h、48 h、72 h 后采用MTT法檢測FLS細胞增殖情況。實驗操作按MTT細胞增殖分析檢測試劑盒說明書進行，采用酶標儀于490 nm波長處檢測每個實驗孔的OD值。

2.4 細胞凋亡實驗取對數期FLS，調整細胞懸液濃度為1×106mL-1，6孔板中每孔加入2 mL。37 ℃、5%CO2培養箱孵育18 h后貼壁，棄上清。NS組加入100 μL含10% NS組大鼠血清的1640 培養基，GC組加入100 μL含10%GC組大鼠血清的1640 培養基，培養48 h后，胰酶消化，收集細胞，PBS清洗2次，300×g離心5 min，收集細胞。采用流式細胞儀按Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作檢測細胞凋亡率。

2.5 細胞周期檢測按照2.4項下的方法準備2組細胞，PBS洗滌離心后加入2 mL預冷75%酒精，4 ℃固定2 h，PBS重懸，洗滌1次。采用流式細胞儀按細胞周期檢測試劑盒說明書操作，分析兩組FLS的細胞周期。

3 結果

3.1 甘草養陰湯對FLS細胞增殖的影響與NS組比較，含藥血清干預48h時后，GC組OD值顯著降低(P<0.05)，含藥血清干預72 h后，GC組OD值極顯著性降低(P<0.001)。提示甘草養陰湯能顯著抑制FLS細胞增殖。見圖1。

3.2 甘草養陰湯對FLS細胞凋亡的影響流式細胞術檢測顯示，與NS組比較，GC組FLS細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)。提示甘草養陰湯能顯著促進FLS凋亡。見圖2。

注：NS：生理鹽水血清組，GC：甘草養陰湯血清組；與NS組比較，*P<0.05，***P<0.001圖1 甘草養陰湯對FLS細胞增殖的影響

注：NS：生理鹽水血清組，GC：甘草養陰湯血清組；與NS組比較，**P<0.01圖2 甘草養陰湯對FLS細胞凋亡的影響

3.3 甘草養陰湯對FLS細胞周期的影響流式細胞技術檢測顯示，與NS組比較，GC組G0/G1期細胞百分比顯著升高(P<0.001)，而S期細胞百分比、G2/M期細胞百分比顯著降低(P<0.000 1，P<0.01)。見表1。

表1 甘草養陰湯對FLS細胞周期影響

4 討論

RA是一種以關節滑膜炎癥為病理機制的自身免疫病，滑膜增生并侵蝕關節軟骨和骨質，最終導致關節破壞甚至畸形[17]。生理狀態下，滑膜產生的透明黏性滑液，可減少運動過程中關節軟骨之間的摩擦，為周圍軟骨提供結構支持和必要的營養供應，從而維持關節功能[18]。FLS是間充質來源的細胞，是滑液主要成分的主要來源細胞，可分泌透明質酸等糖蛋白[19]，尤其是潤滑素(lubricin)，是對關節潤滑至關重要的一種蛋白[20]。此外，FLS表達許多介導細胞黏附的重要分子，例如鈣粘蛋白-11(cadherin-11)、血管細胞黏附蛋白(vascular cell adhesion molecular，VCAM)-1和各種整聯蛋白及其受體[21]。但在RA患者的滑膜中，FLS可以產生許多促炎信號分子，特別是白細胞介素-6(interlukin-6，IL-6)、IL-8、前列腺素和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，參與炎癥反應并直接影響其它炎癥細胞[4]，這些病理過程可通過血小板微泡分泌的IL-1促進FLS活化[22]。在FLS增殖和凋亡的過程中，RA-FLS明顯增生，導致與其它炎癥細胞，包括特異性和非特異性免疫細胞以及血小板一起在滑膜中產生炎癥，并將更多的免疫細胞募集到受損部位(滑膜)，形成炎癥反應的正反饋調節，進一步促成關節破壞。可見，RA-FLS大量增生并伴隨炎癥細胞浸潤和新生血管形成是滑膜增生的基礎[23]。

甘草養陰湯是在東漢末年張仲景《金匱要略》的“甘草瀉心湯”基礎上改良而成。原方在臨床中運用廣泛，包括消化系統如潰瘍性結腸炎、消化性胃潰瘍，神經系統如神經官能癥，免疫系統包括白塞病[24]、TA、內分泌系統及婦科疾病[25]。但原方中半夏具有小毒，黃連口感過于苦，所以對原方的相關中藥進行改良。中醫治療疾病講究辨證論治，臨床上RA包括寒濕痹阻證、濕熱痹阻證、腎氣虛寒證、肝腎陰虛證及瘀血痹阻證等多種證型[26]。按照中醫思維，甘草養陰湯恐難以達到辨證論治的目的，但是甘草、人參、羅漢果、蒲公英等配伍陰陽平和、滋陰扶陽，形成對陰陽的緩沖，可適合多數RA人群。另外，由于RA是系統性疾病，加之西藥的運用，常存在貧血、體力下降等并發癥[27-29]，而人參等具有增強患者體力的補益功效[30-31]。

抑制FLS增殖是RA治療的關鍵靶點。細胞周期的變化是影響細胞增殖與凋亡的關鍵因素，在細胞周期中，G0/G1期進行RNA和核糖體及復制所需酶的合成，S期進行DNA合成，G2/M期進行RNA和蛋白質的大量合成，并完成細胞分裂[30-31]。本研究發現，甘草養陰湯促使G2/M期和S期的FLS細胞比例明顯減少，而G0/G1期細胞明顯增加，進一步證實了甘草養陰湯對細胞增殖和凋亡的影響。

綜合以上研究發現，甘草養陰湯含藥血清能夠抑制RA-FLS的增殖，并在一定程度上促進凋亡。本研究尚存在不足之處，要進一步建立RA動物模型進行相關療效的考察。