針刺對便秘型腸易激綜合征大鼠腸運動及胃腸激素含量的影響

高 紡，周美啟

(1.安徽中醫藥大學中醫學院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫藥科學院亳州中醫藥研究所，安徽 亳州 236800)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)以腹部不適、腹痛、腹脹為主要表現，并伴有排便習慣和(或)糞便性狀改變，且無器質性病變，以便秘型和腹瀉型最為常見。近年來，對于針刺治療便秘型IBS(constipation-predominant irritable bowel syndrome，IBS-C)的機制研究較多，其中腦-腸軸成為近年來研究的熱點之一。然而介導腦與腸之間的聯系中，神經內分泌遞質起到重要作用。其中5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、P物質(substance P，SP)等神經遞質調控胃腸功能有著關鍵性作用。為了進一步研究針刺腧穴是否通過對5-HT、VIP、SP等神經遞質的影響而發揮調控胃腸運動的可能機制，本研究在以往研究的基礎上，建立貼近臨床的IBS-C大鼠模型，以小腸推進率為觀察指標，以5-HT、VIP、SP為生化指標，探討針刺治療IBS-C的機制。

1 材料

1.1 實驗動物 選取健康、清潔級SD大鼠60只，雌雄不拘，體質量(200±20)g，由安徽中醫藥大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(皖)2017—001。隨機選取10只作為正常對照組，其余50只采用寒冷—束縛—饑飽失常綜合法復制IBS-C模型，進行模型評價后隨機選取30只，采用隨機數字表法分為模型組、四單穴組方組、非經非穴組，每組10只。環境溫度約20 ℃，濕度約55%，常規飼料喂養。

1.2 藥品與試劑 活性炭粉末：無錫市亞泰聯合化工有限公司；羧甲基纖維素鈉：廣東味多美食品配料有限公司；5-HT、VIP、SP抗體：北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 儀器與設備 JD-801形態學圖像分析系統：江蘇省捷達科技發展有限公司；BX51熒光顯微鏡：日本奧林巴斯；TB-718C生物組織自動包埋機：湖北泰維科技實業有限公司；Leica2135組織切片機：德國萊卡。

2 方法

2.1 動物模型復制與評價

2.1.1 活性炭粉懸濁液的制備 取5 g羧甲基纖維素鈉，溶于125 mL蒸餾水中，分別加入8 g奶粉、4 g糖、4 g淀粉和1.5 g活性炭末，攪拌均勻，配制成150 mL的黑色半固體糊狀物。冰箱冷藏，用時水浴加溫即可。

2.1.2 IBS-C大鼠模型復制 應用寒冷、饑飽、束縛等多種刺激方法綜合運用，保持應激環境。①束縛敷冰法：首先將大鼠四肢固定，用自制的大鼠腹帶將冰袋和大鼠腹部綁在一起，時刻觀察大鼠生存狀態，至冰袋開始融化時結束。②冰水灌胃法：取出冰水混合物，按每只10 mL/kg，口服。③冰水游泳法：將大鼠放進30 cm高度容器中，注入0 ℃冰水混合物，游泳30 min，觀察大鼠實時動態，以防淹死。④饑飽失常法：饑飽隔日交替進行，且正常飲水。除每日饑飽交替外，其余方法均依次使用。即第1天敷冰袋，給食；第2天口服冰水混合物，禁食；第3天在0 ℃冰水里游泳，給食。3 d為1輪，刺激6輪共計18 d。模型復制期間，每天密切觀察并測量大鼠的大便干濕度、體質量變化并記錄。

2.1.3 模型評價 按文獻[4]方法，末次刺激結束后對模型進行評價。①模型復制前后體質量比較，差異有統計學意義(

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<0.05)；②模型復制后首次排便時間明顯延長(

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05)；③模型復制前后大便干濕度比較，差異有統計學意義(

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05)。將滿足①②③項的大鼠評定為模型復制成功并納入實驗，將其隨機分為模型組、四單穴組方組、非經非穴組，每組10只。

2.2 針刺方法 腧穴定位參照全國普通高等教育“十五”國家規劃教材《實驗針灸學》中的“常用實驗動物針灸穴位”取穴標準。四單穴組方由“天樞”“大腸俞”“曲池”“上巨虛”組成。天樞：臍中旁開約5 mm處，左右側各一，左右交替針刺；大腸俞：第4腰椎下旁開7 mm處，左右側各一，左右交替針刺；上巨虛：小腿背外側上2/5折點處，約當后三里穴下1.5 mm，左右交替針刺；曲池：肘關節外側前部凹陷中，左右交替針刺。非經非穴組即在鼠尾部組織處選取。針刺天樞、大腸俞和曲池、上巨虛時，取同側腧穴，分別刺入正負兩極的2根直徑為0.30 mm、長度為25 mm的毫針，并連接至電針治療儀。兩組刺激參數一致：電流均為1.1 mA，頻率均為2 Hz。連續電針15 min。約24 h電針1次，共7次。正常對照組、模型組均不予電針。

2.3 觀察指標與檢測

2.3.1 小腸推進率 采用活性炭混懸液灌胃法測定小腸推進率。末次針刺結束后，立即給予每只大鼠灌服活性炭混懸液2 mL，20 min后，采用10%水合氯醛將各組大鼠麻醉，開腹，取出小腸，剝離后直鋪于實驗臺上，將幽門至含有黑色碳粉排泄物前沿的腸段自然伸直，用直尺測量其長度及幽門至回盲部自然長度。小腸推進率=幽門至黑色碳粉排泄物前沿的長度/幽門至回盲部長度×100%。

2.3.2 血清5-HT、VIP、SP水平測定 采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉后開腹，從腹主動脈取血，3 500 r/min離心5 min后，取出上清液，于-80 ℃冰箱保存，采用ELISA法檢測5-HT、VIP、SP水平。

2.3.3 結腸組織中5-HT、VIP、SP表達水平的測定 測定腸道長度后，立即剪取回盲部近端結腸2 cm，用生理鹽水沖洗干凈，置于10%甲醛固定液固定24 h后，進行石蠟切片、脫蠟及復水、熱修復浸泡等處理，具體按照免疫組織化學法的常規操作步驟進行。采用圖像分析系統分析陽性細胞表達的平均光密度(optical density，OD)值。

2.3.4 圖像分析 每張切片均在CaseViewer系統300倍焦距下隨機抓拍5個代表性高清視野，用Image J軟件分別分析OD值。

3 結果

3.1 結腸的組織形態學觀察 顯微鏡下每張切片的結腸組織結構清晰，未見紅細胞及炎癥細胞浸潤等異常改變。

3.2 各組大鼠小腸推進率比較 與正常對照組比較，模型組大鼠小腸推進率顯著降低(

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05)；與模型組比較，四單穴組方組大鼠小腸推進率顯著升高(

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05)。見表1。

表1 各組大鼠小腸推進率比較

3.3 各組大鼠血清5-HT、VIP、SP水平比較 與正常對照組比較，模型組大鼠血清5-HT、VIP水平顯著升高(

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05)，SP含量顯著降低(

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05)；與模型組及非經非穴組比較，四單穴組方組大鼠血清5-HT、VIP水平均顯著降低(

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05)，SP水平均顯著升高(

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05)。見表2。

表2 各組大鼠血清5-HT、VIP、SP水平比較

3.4 各組大鼠結腸組織中5-HT、VIP、SP陽性細胞表達水平比較 模型組與非經非穴組5-HT、VIP、SP陽性細胞呈黃棕色或深褐色梭形或顆粒狀，主要分布于黏膜層、肌層，均與四單穴組方組中陽性細胞表達水平有明顯差別。見圖1。與正常對照組比較，模型組大鼠結腸中5-HT、VIP表達水平顯著升高(

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05)，SP表達水平顯著降低(

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05)；與模型組及非經非穴組比較，四單穴組方組大鼠結腸中5-HT、VIP表達水平顯著降低(

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05)，SP表達水平顯著升高(

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05)。見表3。

圖1 大鼠結腸組織中5-HT、VIP、SP陽性細胞表達水平(免疫組織化學法，10×30倍)

表3 各組大鼠結腸組織中5-HT、VIP、SP陽性細胞表達水平比較

4 討論

中醫學并未有IBS的詳細記載，依據其主要臨床表現可將其歸屬于“泄瀉”“腹痛”“便秘”“郁證”等范疇。近年來，IBS患者越來越多并趨向年輕化，臨床上多采用藥物對癥治療，但收效甚微。IBS已成為國內外亟待解決的難題之一。針灸作為中醫學的獨特療法，近年來在預防與治療IBS方面發揮了重要作用。越來越多的臨床及實驗研究證實，針灸對胃腸道調節具有雙向性，使失常的腸道運動功能趨向正常化，能夠調節腦腸肽的表達水平、胃腸動力、內臟高敏感性及精神異常等。針灸因其療效確切，無明顯不良反應，便于操作等優點，而被廣泛運用于治療消化道疾病，越來越被全世界人們所接受，但其治療IBS的機制尚未明了。

5-HT是一種單胺類神經遞質，大多分布于胃腸道內和中樞神經內，主要由腸嗜鉻細胞合成分泌，通常與三磷酸腺苷等物質一起儲存于細胞顆粒內。在受到刺激時，5-HT從顆粒內釋放，通過與其受體結合直接作用于腸道平滑肌細胞，影響腸道動力與腸道敏感性。如通過下調腸道組織中5-HT的陽性表達水平調節腸道動力及腸道敏感性，發揮對IBS-C治療作用。研究發現，5-HT在腦-腸聯系中，一方面作用于內臟傳入神經及腸神經系統，促使多種腦腸肽的分泌與激活，參與腦與腸之間信號的傳遞；另一方面，5-HT與其受體結合，致使腸道運動、分泌及敏感性的改變，產生一系列的臨床癥狀。另外，VIP不僅分布于黏膜固有層和肌層神經纖維的胃腸道中，而且在中樞神經和外周神經末稍周圍也有大量分布。因此，VIP對腸道細胞有直接的作用，VIP既是一種胃腸道激素又是一種非腎上腺能非膽堿能神經抑制系統的神經遞質，通過兩條途徑即一氧化氮相關性途徑和cAMP依賴的蛋白激酶途徑作用于平滑肌的運動，具有減慢胃排空，調節胃腸道規律性蠕動和參與結腸的節段非推進性運動等作用。VIP大多分布于胃腸道內和中樞性神經內，加快胃腸蠕動，增強收縮消化道平滑肌，促進結腸的節段推進運動。綜上，5-HT在機體受到刺激時會大量分泌，但必須與其受體結合才能發揮調節胃腸道功能作用。VIP作為一種抑制性神經遞質，具有減少胃腸分泌，抑制胃腸蠕動的作用。SP作為一種興奮性腦腸肽神經遞質，與VIP胃腸功能作用相對應。因此，在生理狀態下，以上腦腸肽在維持正常胃腸道功能方面起到至關重要的作用。故本研究以5-HT、VIP、SP作為研究的切入點，初步分析針刺對IBS-C大鼠可能的作用機制。

天樞穴是大腸之募穴，是臟腑之氣匯聚之處，針刺天樞穴能夠調節胃腸功能。大腸俞為大腸經的背部俞穴，是大腸經氣輸注的部位，是胃腸疾病的反應點，也是治療便秘的有效輸穴。曲池穴是手陽明大腸經之合穴，上巨虛穴為大腸之下合穴，“合治內腑”，主治胃腸疾病。實驗研究表明，電針四單穴能夠降低下丘腦及結腸組織5-HT1AR和c-fos蛋白表達，改善IBS的臨床癥狀，艾灸天樞、大腸俞能抑制VIP、SP表達或上調水通道蛋白8的表達水平，從而改善腸道疾病。由此可見，針刺四單穴對胃腸功能的調節具有重要作用。以往研究結果證實，針刺四單穴對IBS-C大鼠癥狀的改善最顯著，故本研究選用四單穴為治療腧穴。

本實驗結果顯示，模型組大鼠小腸推進率明顯降低，結腸、血清中5-HT、VIP水平明顯升高，SP水平明顯降低，說明腸道蠕動減慢，模型復制成功。與模型組比較，四單穴組方組小腸推進率明顯升高，結腸、血清中5-HT、VIP表達水平明顯降低，SP水平明顯升高，差異均有統計學意義(

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05)。結果說明針刺四單穴對IBS-C具有明顯的改善作用，其作用機制可能與降低結腸、血清中5-HT、VIP表達水平，升高SP的表達水平有關。