電針太沖、足三里對自發性高血壓大鼠心肌纖維化的改善作用

蔚鵬程，薛艷君，吳嬌娟，呂桃桃，張旭東，楊可楨，劉清國

(北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京 100029)

最新流行病學調查顯示，2012-2015年中國18歲及以上居民高血壓病的粗患病率為27.9%，且仍呈上升的趨勢。高血壓病作為一種慢性疾病，長期進展會引起心肌重構，心肌纖維化是心肌重構的重要病理過程，纖維化帶來的心臟功能下降長期發展會導致心力衰竭，嚴重可危及生命。目前，國外進行了多項臨床試驗，但仍未取得滿意療效。同時，已有多項研究證實中醫藥在心肌纖維化的治療方面具有良好療效，且無明顯不良反應。目前，關于針刺治療高血壓病引起的心肌纖維化的相關研究較少。本研究通過觀察電針干預自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)“太沖”“足三里”穴對大鼠心肌重構的影響，初步探討電針改善高血壓心臟損傷的可能機制。

1 材料

1.1 實驗動物 選用36只SHR，12只Wistar大鼠，均為SPF級，7周齡，雄性，體質量(200±15)g，購于北京維通利華公司實驗動物中心[動物生產許可證號：SCXK(京)2016—0006]。購進后適應性喂養1周。

1.2 實驗試劑與儀器 恒溫式無創血壓儀(BP-6)：成都泰盟科技有限公司；中研太和牌無菌針灸針(0.25 mm×13 mm)：無錫佳健醫療器械有限公司；韓氏穴位針灸刺激儀(HANS-200E)：南京濟生醫療科技有限公司；酶聯免疫試劑盒(JL11637)：上海江萊生物科技有限公司；Masson試劑盒(MD7056)：北京百奧思科生物醫學技術有限公司；氯沙坦鉀片(J20180054，每片100 mg)：默沙東制藥有限公司；Trizol(10296028)：美國Invitrogen；熒光定量PCR儀(Step One Software)：美國Applied Biosystems。

2 方法

2.1 動物分組 將SHR按隨機數字表法隨機分為模型組、電針組、藥物組，每組12只；另設12只Wistar大鼠作為空白組。

2.2 干預措施 ①空白組與模型組：只進行抓取及固定刺激，讓大鼠鉆入自制鼠套中，并將鼠套固定于實驗桌上，固定時間20 min，其余各組采用相同固定方式。②灌胃操作：將氯沙坦鉀片用研缽研磨成細粉后，根據大鼠體質量，按照30 mg/kg稱出對應的藥粉用量，將藥粉用純水溶解成3 mg/mL的懸濁液，灌胃前充分搖勻，按照大鼠體質量以10 mL/kg藥液量進行灌胃，并同樣進行抓取固定刺激；空白組、模型組、電針組用等量純水進行灌胃。各組均每周灌胃6 d，休息1 d。③針刺操作：分別于雙側太沖穴直刺1～2 mm(皮下層)、足三里穴直刺4～5 mm(肌肉層)，進針后同側太沖與足三里穴上的毫針分別連接電針儀的正極與負極，刺激強度為0.3 mA，頻率2 Hz，刺激20 min。實驗周期21 d，每隔6 d休息1 d。

2.3 血壓測量 于治療的前1天及治療第7、14、21天上午的固定時間段在大鼠清醒狀態下使用無創血壓儀測量其尾動脈收縮壓，每只大鼠連續測量3次，取平均值以減少誤差。

2.4 取材與指標檢測 取材前禁食12 h，不禁水，大鼠腹腔注射5%水合氯醛溶液(麻醉劑量：6 mL/kg)。麻醉后開胸，取心臟，每組隨機取3只大鼠心臟，置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋后切成5 μm厚度切片。Masson染色，按照試劑盒操作說明書處理，封片后通過顯微鏡觀察左心室心肌病理改變。各組其余大鼠取心尖組織留用，經液氮凍存后，存放在-80 ℃冷凍室內，酶聯免疫吸附法檢測各組大鼠左心室中血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)的含量，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。qPCR檢測大鼠左心室細胞外信號調節激酶1/2(extracellular-regulated kinase 1/2，ERK1/2)、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ mRNA含量。將收集的心肌組織加入Trizol溶液研磨，按Trizol試劑的操作說明書進行分離提取心肌組織總RNA，合成第一鏈cDNA。合成引物序列如下：

ERK1/2 正向:5′-ACCTGAAGCCCTCCAAT-3′；反向:5′-CTCGGTAAGAAAGCCAGTGTGGTCG-3′。膠原蛋白Ⅰ正向：5′-CCAGCGGTGGTTATGACTT-3′；反向：5′-GGCTGCGGATGTTCTCAAT-3′。膠原蛋白Ⅲ正向：5′-CCACCCTGAACTCAAGAGC-3′；反向：5′-CATCTGTCCACCAGTGCTT-3′。GAPDH正向：5′-AAGATGGTGAAGGTCGGTGT-3′；反向：5′-GCTTCCCATTCTCAGCCTTG-3′。反應條件為預變性：95 ℃ 5 min；PCR反應：95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循環40次；融解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，反應結束后確認擴增曲線和融解曲線。

3 結果

3.1 不同時點各組大鼠收縮壓比較 與空白組比較，各時點模型組大鼠尾動脈收縮壓均顯著升高(

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05)；與模型組比較，治療第14天、第21天電針組、藥物組收縮壓顯著降低(

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05)。見表1。

表1 不同時點各組大鼠收縮壓比較

3.2 各組大鼠心肌組織變化比較 經Masson染色后，正常心肌組織為紅色，膠原纖維為藍色。電針組及空白組心肌組織形態正常，空白組在血管周圍可見少量膠原纖維均勻分布；模型組膠原纖維含量明顯增加，并深入心肌組織間隙，呈明顯不均勻分布，形態雜亂；藥物組心肌組織間有少量膠原纖維，但含量明顯減少。見圖1。

3.3 各組大鼠左心室Ang Ⅱ含量，ERK1/2、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ mRNA表達水平比較 與空白組比較，模型組大鼠左心室AngⅡ含量，ERK1/2、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ mRNA表達水平均顯著升高(

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05)；與模型組比較，電針組、藥物組大鼠左心室AngⅡ含量，ERK1/2、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ mRNA表達水平均顯著降低(

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05)。見表2。

表2 各組大鼠左心室AngⅡ含量，ERK1/2、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ mRNA表達水平比較

注：A.電針組；B.空白組；C.模型組；D.藥物組

4 討論

高血壓病可歸屬于中醫學“眩暈”“頭風”等病范疇。《素問·標本病傳論》：“肝病，頭目眩，脅支滿。”《靈樞·經脈》：肝經“上出額，與督脈會于巔。”《醫宗金鑒》：“肝性急善怒……發于上，則頭眩耳鳴，而或為目赤。”可見，眩暈與肝臟密切相關。研究數據分析指出，各種癥狀共同提示原發性高血壓的基本病機與肝密切相關。《靈樞·九針十二原》：“五臟有疾，當取之十二原”，太沖為肝經原穴，能夠疏肝理氣、平肝潛陽，為治療高血壓病要穴之一。足三里為陽明經合穴、下合穴，《靈樞·邪氣藏府病形》：“合治內府”，足三里善補益一身之氣，通調氣血，血充則肝血旺，血旺則柔肝而平和陰陽，同時補脾胃并調肝，扶土抑木。《難經·六十八難》：“合主逆氣而泄”，足三里有降逆氣，調理氣機的作用。臨床研究顯示，針刺足三里穴可益氣扶本，促進氣血運轉，能夠有效治療頑固性高血壓。

高血壓病作為一種慢性疾病，其長期存在會加重心臟負荷，導致心肌的結構功能發生改變，主要表現為心肌肥大和心肌纖維化的形成。纖維化的主要特征是心肌間質成纖維細胞增殖以及其分泌的細胞外基質蛋白沉積。

AngⅡ作為腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system,RAS)的主要效應成分，通過與靶細胞膜上的血管緊張素Ⅰ型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)結合來發揮作用。除收縮血管等升壓效應外，AngⅡ與AT1R結合后還會介導細胞增殖和纖維沉積等進程。隨著研究的深入，除了在循環系統中的RAS外，在不同的組織中也發現了RAS成分的存在，因此有了局部或組織RAS的概念。機體體液量的快速調節與循環系統中的RAS關系更加密切，而在高血壓引起的器官重構方面，局部或組織內的RAS則發揮著主要作用。本研究發現，高血壓大鼠左心室組織AngⅡ表達水平上調，這提示高血壓大鼠左心室可能存在局部RAS激活。

在RAS介導的心臟病理改變過程中，ERKs是其中的重要環節。作為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)家族成員之一，ERK1/2轉導途徑與細胞肥大、增殖等過程密切相關，是多種促增殖信號轉導途徑的核心成分。AngⅡ與AT1R結合后能迅速激活ERK1/2信號轉導途徑，促進心肌成纖維細胞轉化、增殖，進而導致膠原的合成和分泌增加。辛博等通過皮下植入膠囊滲透壓泵的方法，連續4周持續滴注AngⅡ，病理結果顯示，小鼠心肌間質膠原含量顯著增多，出現心肌間質纖維化現象，膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ等與纖維化相關的基因表達水平均上調，說明AngⅡ誘導了小鼠心肌纖維化的發生。AngⅡ可激活心肌中ERK1/2通路，磷酸化的ERK1/2介導了心肌細胞間基質的沉積和心肌纖維化的發展。周易等通過收集擴張型心肌病心臟移植術患者的心肌組織，檢測擴張型心肌病患者心肌組織中MAPKs信號通路的磷酸化水平，結果發現MAPKs磷酸化激活與擴張型心肌病患者心肌纖維化的發生發展密切相關，抑制MAPKs信號通路激活可能會有效改善擴張型心肌病患者的心肌纖維化。吳奇芳等研究表明，敲除TRPC6基因可下調ERK信號通路的活性，從而減輕異丙腎上腺素誘導的心肌纖維化。

正常生理狀態下，心肌中Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白所占比例相對恒定，以維持心臟正常功能和結構，而當心肌纖維化發生時，心肌組織中膠原蛋白Ⅰ與膠原蛋白Ⅲ合成增加，比例明顯升高。心肌纖維化的金標準是對組織內的膠原蛋白進行直觀的檢測，并且組織學研究結果指出，高血壓所導致的纖維化具有由血管周圍開始發生，并逐步向肌間隙蔓延的特征。本研究顯示，電針組及空白組心肌組織形態正常，空白組在血管周圍可見少量膠原纖維均勻分布；模型組在血管周圍膠原纖維含量明顯增加，并深入心肌組織間隙，呈明顯不均勻分布，形態雜亂；藥物組也可見組織間少量膠原纖維，但含量明顯減少。

本實驗通過對SHR左心室AngⅡ含量，ERK1/2、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ mRNA進行檢測發現，相比于空白組，模型組大鼠左心室AngⅡ含量，ERK1/2、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ mRNA表達水平明顯升高(

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<0.05)；相比于模型組，電針組大鼠左心室AngⅡ含量，ERK1/2、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ mRNA表達水平明顯降低(

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05)，說明模型組存在AngⅡ-AT1R-ERK1/2-膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ通路的激活，而電針能夠對AngⅡ、ERK1/2信號通路產生影響，進而下調大鼠心肌膠原蛋白的表達，從而起到抑制高血壓心肌纖維化的作用，這可能是針刺能夠有效減緩高血壓心臟損傷的機制之一。