養(yǎng)陰活胃合劑對慢性萎縮性胃炎大鼠血清胃蛋白酶原和胃組織水通道蛋白的影響

馬慧娟，謝姍珊，曙阿克·哈爾恒，曾斌芳

(新疆醫(yī)科大學，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830000)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)，多由脾升胃降功能失調，運化失司，脾胃虛弱，痰氣瘀交阻于胃脘所致，多呈虛實夾雜、寒熱并見之勢。其特征是胃黏膜萎縮，胃酸分泌減少，胃黏膜病理改變以及腸腺上皮化生，而具有廣泛腸腺上皮化生的嚴重胃炎是胃癌的主要危險因素。目前，西醫(yī)多以抗炎為主，但預后較差，CAG易復發(fā)。中醫(yī)學非常重視“胃氣”，認為“人以胃氣為本”，主張標本兼治，在治療CAG上有顯著療效。養(yǎng)陰活胃合劑對CAG患者具有較好的療效，可迅速改善臨床癥狀，逆轉胃黏膜的病理狀態(tài)，使黏膜腺體排列整齊，使腺體與胃小凹固有層厚度正常，減輕胃竇部炎癥細胞浸潤。

1 材料

1.1 實驗動物 66只6～8周齡SPF級SD雄性健康大鼠，體質量180～200 g，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心[生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2018—0002]提供。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心SPF級屏障實驗室，相對濕度40%～55%，室溫(23±2)℃，運用12 h光暗周期循環(huán)，常規(guī)標準飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 養(yǎng)陰活胃合劑中藥免煎顆粒購買于江陰天江藥業(yè)有限公司，由蘆根30 g，海螵蛸20 g，旋覆花12 g，麩炒白術、茯苓各10 g，炒雞內(nèi)金、醋莪術各9 g，炒牡丹皮、制遠志、砂仁、炙甘草各6 g組成。

氨水(C10923265)：麥克林有限公司；脫氧膽酸鈉(407H021)：北京索萊寶科技有限公司；胃復春片(19066206)：杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司；大鼠胃蛋白酶原Ⅰ(pepsinogen Ⅰ，PGⅠ)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(JL21317)、大鼠胃蛋白酶原Ⅱ(pepsinogen Ⅱ，PGⅡ)ELISA試劑盒(JL21318)：江萊生物；DAB顯色試劑盒(2024G0518)、兔二步法試劑盒(2023C0819)：中杉金橋；逆轉錄試劑盒(RR047A)、熒光定量PCR試劑盒(AK31129A)：Takara。

1.3 主要儀器 全波長酶標儀(Multiskan GO)：Thermo Fisher；低溫高速臺式冷凍離心機(3-30K)：Sigma；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9082)：上海一恒科學有限公司；熒光定量PCR儀(Quant Studio 6 Flex)：Applied biosystems。

2 方法

2.1 模型復制和給藥 參考文獻[8]方法并加以改良，運用綜合方法復制CAG大鼠模型。將66只SPF級SD雄性大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按體質量分為正常組11只，其余55只用于復制CAG模型。模型復制方法：給予大鼠0.1%氨水，讓其自由飲用。模型復制第1～9周，每周三、周六采用10%乙醇給予大鼠灌胃，劑量為5 mL/kg；第10～12周，每周三、周六采用30%乙醇灌胃，劑量為5 mL/kg。模型組每周除周三、周六外，采用20 mmol/L脫氧膽酸鈉灌胃，劑量為5 mL/kg。每2 d禁食1 d，不禁水。正常組大鼠給予常規(guī)飲水和飼料。模型復制第4、8、12周，隨機抽取1只大鼠進行胃黏膜病理檢查，確定模型復制成功后，將其隨機分為模型組，養(yǎng)陰活胃合劑高、中、低劑量組，胃復春組，每組10只。養(yǎng)陰活胃合劑低、中、高劑量組分別按60 kg成人臨床劑量的2.7、5.4、8.1倍給予養(yǎng)陰活胃合劑免煎劑0.84、1.68、2.52 g/(kg·d)。對照組按60 kg成人臨床劑量的5.4倍給予胃復春1.44 g/(kg·d)灌胃，共8周。模型組按1.5 mL/d給予無菌水灌胃。實驗過程中，因灌胃不當致大鼠死亡2只，不明原因死亡5只。

2.2 標本采集 末次給藥結束，禁食不禁水24 h后，稱質量，給予10%水合氯醛35 mL/kg進行皮下麻醉后，備皮，進行食管導管插管。同時腹主動脈采血，4 ℃冰箱過夜后，3 500 r/min離心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱。沿腹剪開，將胃組織與其他組織輕輕分離，同時在近幽門處剪開插入另一導管。用止血鉗和手術縫合線結扎幽門和賁門，從插管處勻速注入5 mL蒸餾水至胃腔，再從幽門端導管處，收集胃液15 mL至離心管中，再以4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取其上清液至新的EP管中。移液過程中，每個樣本先取一滴胃液用pH試紙測試胃液pH值，快速讀取，詳細記錄后，將胃液凍存至-80 ℃冰箱。同時取全胃，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，做大體觀察，稱質量并記錄。每個樣本沿胃竇部、胃底部各取1 cm×0.5 cm組織條兩塊，取胃竇部和胃底部各一塊組織條放入用鉛筆標記好號碼的包埋盒中，再用4%多聚甲醛組織固定液固定72 h；其余大鼠組織塊和組織條放入標記好的凍存管中，迅速存入液氮中，以備后續(xù)實驗。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 一般指標觀察 實驗過程中，觀察各組大鼠鼻舌、爪甲、肛門、皮毛變化，飲食、飲水情況，大便性狀、氣味改變，日常精神動態(tài)等，并在每周三稱體質量。

2.3.2 胃分泌指標檢測 采用廣泛試紙法測試胃液pH值，采用酸堿滴定法測定胃液總酸度。

2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠血清PGⅠ、PGⅡ水平 取出實驗所需試劑盒和大鼠血清，按照20∶1的比例配置洗滌液，并按試劑盒說明書進行操作。各孔相應加入同容積上樣液50 μL，標準品孔加不同梯度濃度的標準品(PGⅠ：2、4、8、16、32、64 ng/mL；PGⅡ：0.5、1、2、4、8、16 ng/mL)，空白孔設一復孔加入樣本稀釋液，樣本孔加入各樣本。再加入100 μL HRP標記的待檢測抗體，封板膜正確封孔，37 ℃恒溫箱孵育1 h。甩掉反應液，濾紙拍干，每孔加350 μL洗滌液，靜置1 min，重復洗板5次。各孔加底物A、B各50 μL，錫紙包蓋，37 ℃恒溫箱孵育15 min。再加50 μL終止液，快速使用酶標儀測定出450 nm波長處各孔光密度值，制作大鼠血清PGⅠ標準品線性回歸曲線，計算大鼠血清PGⅠ和PGⅡ蛋白濃度，并計算其胃蛋白酶原比值(pepsinogen ratio，PGR)，即PGⅠ/PGⅡ比值。

2.3.4 采用RT-qPCR法檢測胃組織水通道蛋白(aquaporin，AQP)1、AQP3和AQP4 mRNA表達水平 取出大鼠組織凍存管，置于冰上，用無菌剪刀剪出約0.1 g胃組織，研磨缽中倒入液氮，快速研磨成干粉狀，裝入已經(jīng)標記好的加有Trizol的無酶EP管中，冰上裂解10 min。氯仿分層，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，用同容積異丙醇沉淀RNA，加入75%乙醇1 mL以清洗RNA沉淀，棄去乙醇，晾干，再加入相應的無酶水溶解RNA，在A/A上，檢測并確定RNA純度和濃度。嚴格按照逆轉錄試劑盒步驟，去除基因組DNA，反轉錄合成cDNA，放置-80 ℃保存。嚴格遵照PCR試劑盒說明書配置PCR反應體系，上機進行擴增。各目的蛋白的引物由上海生工設計生產(chǎn)，引物序列見表1。采用2-ΔΔ法計算目的基因的相對表達水平。ΔΔ

C

=(

C

-

C

)-(

C

-

C

)。

表1 各檢測指標引物序列

3 結果

3.1 各組大鼠一般狀況比較 實驗過程中，正常組大鼠飲食、飲水量較其他組增多，喜動好斗，毛色白而順滑，而模型組大鼠喜聚集，喜靜臥，活動減少，部分大鼠后腿發(fā)軟，毛色黃且脫落較多，舌質淡白，偶有紫暗，爪甲淡白，肛周污染，大便呈黑褐色，偶有大便不成形，氣味臭穢，兼見大便時有溏泄；經(jīng)治療后，養(yǎng)陰活胃合劑高、中、低劑量組和胃復春組大鼠毛發(fā)脫落減輕，活動量適中，飲食、飲水量較前增加，無溏泄。

3.2 各組大鼠體質量比較 給藥0 d時，與正常組比較，各給藥組大鼠體質量顯著降低(

P

<0

.

05)。給藥4周后，與正常組比較，模型組大鼠體質量顯著減少(

P

<0

.

05)；與模型組比較，養(yǎng)陰活胃合劑低、中、高劑量組和胃復春組大鼠體質量均顯著升高(

P

<0

.

05)。給藥8周后，與正常組比較，模型組大鼠體質量顯著降低(

P

<0

.

05)；與模型組比較，各給藥組大鼠體質量均顯著升高(

P

<0

.

05)。見表2。

表2 不同時點各組大鼠體質量比較

3.3 各組大鼠胃液pH值和總酸度比較 與正常組比較，模型組大鼠胃液pH值顯著升高(

P

<0

.

05)，總酸度顯著降低(

P

<0

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05)。與模型組比較，各給藥組大鼠胃液pH值均顯著降低(

P

<0

.

05)，總酸度顯著升高(

P

<0

.

05)。與養(yǎng)陰活胃合劑低劑量組比較，養(yǎng)陰活胃合劑中、高劑量組和胃復春組胃液總酸度升高(

P

<0

.

05)。見表3。

表3 各組大鼠胃液pH值和總酸度比較

3.4 各組大鼠血清PGⅠ、PGⅡ水平和PGR比較 與正常組比較，模型組大鼠血清PGⅠ水平和PGR降低，PGⅡ水平升高(

P

<0

.

05)。與模型組比較，各給藥組大鼠血清PGⅠ水平和PGR均升高(

P

<0

.

05)，養(yǎng)陰活胃合劑中、高劑量組和胃復春組PGⅡ水平降低(

P

<0

.

05)。與養(yǎng)陰活胃合劑低劑量組比較，其余給藥組的PGⅠ水平和PGR升高，PGⅡ水平降低(

P

<0

.

05)。見表4。

表4 各組大鼠血清PGⅠ、PGⅡ和PGR水平比較

3.5 各組大鼠胃組織AQP1、AQP3、AQP4 mRNA相對表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠胃組織AQP1 mRNA表達水平顯著升高(

P

<0

.

05)，AQP3、AQP4 mRNA表達水平顯著降低(

P

<0

.

05)。與模型組比較，各給藥組AQP1 mRNA表達水平顯著降低(

P

<0

.

05)；養(yǎng)陰活胃合劑低、中劑量組和胃復春組AQP3 mRNA表達水平顯著升高(

P

<0

.

05)，養(yǎng)陰活胃合劑中、高劑量組和胃復春組AQP4 mRNA表達水平顯著升高(

P

<0

.

05)。見表5。

表5 各組大鼠AQP1、AQP3、AQP4 mRNA相對表達水平比較

4 討論

CAG可歸屬于中醫(yī)學“痞滿”范疇。張仲景提出外感病下之過早致脾胃損傷，正虛邪陷，中焦氣機升降失常可致痞的病機。至李東垣進一步闡明脾虛濕困、濕阻中焦、脾胃虛弱等均可致痞滿。CAG多由脾胃升降功能失調，運化失司，脾胃虛弱，痰瘀交阻于胃脘所致，多呈虛實夾雜、寒熱并見之證。又如《蘭室秘藏》曰：“或多食寒涼，及脾胃久虛之人，胃中寒則脹滿，或臟寒生滿病?！?/p>

葉天士《臨證指南醫(yī)案》云：“太陰濕土，得陽始運；陽明燥土，得陰自安?！逼⒁陨秊榻?，胃以降為和，以達到脾胃以平為期的生理狀態(tài)。養(yǎng)陰活胃合劑中，蘆根性甘、味寒，歸肺、胃經(jīng)，功能清熱除煩、生津止嘔、利尿，既可養(yǎng)陰，又可用于和胃降逆，故為君藥；臣藥配伍莪術、牡丹皮、海螵蛸，取其行氣止痛、消食化積、和胃止痛止血之功，白術、茯苓益氣健脾，化濕助運；佐以旋覆花、炙遠志疏肝健脾，化痰通絡，雞內(nèi)金、砂仁健脾和胃，消食化積，炙甘草為方中使藥，調和諸藥。《醫(yī)學衷中參西錄》：“雞內(nèi)金，雞之脾胃也，善化瘀積。”中焦脾胃，脾升胃降，運化水谷精微，若中焦氣機不利，氣化受阻，升降失調，故而出現(xiàn)脘痞脹滿、不思飲食之癥。白術與雞內(nèi)金同用，可化瘀消積，更能健脾益胃，脾胃強健則氣機條暢，消積化滯?！夺t(yī)學衷中參西錄》指出：“炙遠志若以炙甘草輔之……入胃又能助生酸汁，使人多進飲食，和平純粹之品，固無所不宜也?！陛g配伍茯苓、白術等健脾補氣之劑，可改善脾胃虛弱運化乏力之脘痞脹滿、不思飲食等證。

研究表明，中藥可以改善動物組織的分泌功能，有調節(jié)胃酸分泌的作用。胃黏液量的變化、胃酸的增減、幽門螺桿菌感染和胃蛋白酶活力的變化均影響胃分泌功能。而改善胃分泌功能則能有效防治幽門螺桿菌感染，改善胃內(nèi)環(huán)境。目前，胃功能檢測被廣泛運用在胃癌的早期診斷中，對于臨床診療發(fā)揮重要作用。

各給藥組CAG大鼠胃液pH值均明顯降低，胃液總酸度顯著升高，且養(yǎng)陰活胃合劑高、中劑量和胃復春降低胃液pH值和升高胃液總酸度的作用優(yōu)于養(yǎng)陰活胃低劑量組。各給藥組大鼠血清PGⅠ表達水平顯著升高，PGⅡ水平降低，PGR明顯升高。研究結果表明，養(yǎng)陰活胃合劑通過上調PGⅠ表達水平和PGR改善CAG大鼠胃黏膜功能狀態(tài)，以達到治療CAG的目的。且經(jīng)各給藥組干預后，大鼠體質量也有明顯回升。大鼠胃黏膜細胞內(nèi)滲透壓增加，誘導AQP3、AQP4表達水平升高，轉運細胞間隙水至黏膜細胞，導致胃黏膜充血、水腫，提示CAG是因為大鼠胃黏膜炎癥細胞浸潤，細胞間滲透壓改變，AQP3、AQP4 mRNA表達水平降低，轉運進入細胞內(nèi)的水減少，進而誘導胃黏膜腺體萎縮。各給藥組大鼠胃組織AQP1 mRNA表達水平下調，AQP3和AQP4 mRNA表達水平明顯上調，可促進更多的細胞間隙水轉運至黏膜細胞，抑制胃黏膜腺體萎縮。

綜上所述，養(yǎng)陰活胃合劑改善胃分泌功能的機制與其調節(jié)AQP的基因表達水平，影響胃黏膜細胞的水液代謝有關。