軟肝飲對HBV轉基因小鼠HBV-DNA、肝纖維化四項指標及炎癥細胞因子表達的影響

施 美，侯 勇，周 灝，劉麗麗，張先姚，張國梁

(1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031；2.安慶市中醫院，安徽 安慶 246000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈世界流行性。據WHO報道，全球約有2.57億慢性HBV感染者。全球每年約有88.7萬人死于HBV感染相關疾病，其中肝硬化占30%，原發性肝癌占45%。在中國所有肝硬化和原發性肝癌患者中，由HBV感染所致者分別占77%和84%。慢性乙型病毒性肝炎的治療目標是最大限度地長期抑制HBV復制。目前抗病毒藥物主要有核(苷)酸類似物和干擾素，兩者有其各自的優缺點。近年來，隨著對中醫藥研究的不斷深入，研究者發現中醫藥在慢性乙型病毒性肝炎的治療中發揮著重要的特色與優勢。軟肝飲是基于長期臨床經驗和實驗研究結果的自擬中藥復方，可有效治療慢性乙型病毒性肝炎。研究發現，軟肝飲在降低HBV轉基因小鼠HBV-DNA含量，改善層黏連蛋白(laminin，LN)、透明質酸(haluronic acid，HA)、Ⅳ型膠原(collage type Ⅳ，Ⅳ-C)、Ⅲ型前膠原(procollagen type Ⅲ，PCⅢ)水平，調控白細胞介素2(interleukin-2，IL-2)、白細胞介素4 (interleukin-4，IL-4)、白細胞介素10 (interleukin-10，IL-10)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)水平方面有一定作用，現報道如下。

1 材料

1.1 實驗動物 50只SPF級BALB/c品系HBV轉基因小鼠(雌雄各半，35～40日齡，體質量18～25 g)、10只與HBV轉基因小鼠同窩的非HBV轉基因正常小鼠(雌雄各半，35～40日齡，體質量18～25 g)：購自中國人民解放軍第458醫院全軍肝病中心[生產許可證號：SCXK(軍)2017—0016]。將小鼠飼養于安徽中醫藥大學第一附屬醫院動物房(普通級飼養室)，在開始正式實驗前小鼠先適應性飼養1周，觀察小鼠的各項情況。實驗小鼠的飼養條件嚴格按照《實驗動物管理條例》實行，每籠5只，雌雄分籠飼養，使用獨立的通氣設備，相對濕度為40%～60%，飼養溫度為22～24 ℃，每日24 h中，其中12 h光照環境，另外12 h黑暗環境。每3 d更換一次飼料和水，所有的籠具及墊料均作滅菌處理后使用。對于死亡小鼠及時查明死因，然后按相關要求妥善處理。

1.2 藥物與試劑 軟肝飲(丹參、黃芪各30 g，醋鱉甲20 g，赤芍15 g，莪術、柴胡、炒白術各10 g，三七、五味子各5 g)由安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供，煎藥室煎制，濃度為2 g/mL。恩替卡韋分散片(每片0.5 mg，批號 197073108)：安徽貝克藥業有限公司。

小鼠IL-4 ELISA試劑盒(KS11806&08/2019)、小鼠IL-10 ELISA試劑盒(KS10138&08/2019)、小鼠IL-2 ELISA試劑盒(KS12106&08/2019)、小鼠IFN-γ ELISA試劑盒(KS10967&07/2019)：科順生物；EZ-10 Total RNA Mini-Preps Kit(B618583)：Sangon Biotech；ABScript Ⅱ RT Master Mix for qPCR with gDNA Remover(RK20403)：ABclonal；TB GreenPremix Ex TaqⅡ (Tli RNaseH Plus)(RR820A)：TAKARA。

1.3 實驗儀器 酶標儀(BioRad 680)、常規PCR儀(Mycycler)、real-time PCR儀(IQ5)：BioRad；分光光度儀(754PC)：上海菁華。

2 方法

2.1 分組及給藥方法 將50只HBV轉基因小鼠隨機分為軟肝飲高劑量組、軟肝飲中劑量組、軟肝飲低劑量組、恩替卡韋組、模型組，每組10只，另選取10只正常小鼠作為空白對照組，均飼養于安徽中醫藥大學第一附屬醫院動物房(普通級飼養室)，實驗前先適應性飼養1周。每天分別給藥1次。連續4周。軟肝飲高劑量組小鼠每只灌胃0.4 g(相當于臨床用量9倍)，軟肝飲中、低劑量組小鼠每日分別灌胃0.2、0.1 g，3組小鼠每日灌胃容積均為0.2 mL。恩替卡韋組以恩替卡韋分散片0.5 mg溶于77 mL生理鹽水中，每日按0.2 mL劑量灌胃。模型組及空白對照組以生理鹽水每日0.2 mL灌胃。各組小鼠自由飲水，每日進食相等，均在相同環境下飼養。

2.2 標本采集及監測方法 治療4周后，采用實時熒光定量PCR技術檢測外周血及肝組織中HBV-DNA表達水平，采用ELISA方法檢測小鼠血清LN、HA、Ⅳ-C、PCⅢ、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的水平。

3 結果

3.1 各組小鼠血清和肝組織HBV-DNA表達水平比較 與模型組比較，軟肝飲高、中、低劑量組和恩替卡韋組小鼠血清和肝組織中HBV-DNA表達水平明顯降低，差異有統計學意義(

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05)；軟肝飲的作用呈明顯的劑量依賴性(

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05)。見表1。

表1 各組小鼠血清和肝組織中HBV-DNA表達水平比較

3.2 各組小鼠血清肝纖維化四項指標表達水平比較 與空白對照組比較，模型組小鼠血清LN、HA、Ⅳ-C、PCⅢ表達水平顯著升高(

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05)；與模型組比較，軟肝飲高劑量組和恩替卡韋組LN、HA、Ⅳ-C、PCⅢ表達水平顯著降低(

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05)；軟肝飲降低血清LN、HA、Ⅳ-C的作用呈劑量依賴性(

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05)。見表2。

表2 各組小鼠血清LN、HA、Ⅳ-C、PCⅢ水平比較

3.3 各組小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平比較 與空白對照組比較，模型組IL-2、IL-10、IFN-γ水平顯著降低(

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05)，IL-4水平顯著升高(

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05)；與模型組比較，軟肝飲高、中劑量組和恩替卡韋組IL-4水平顯著降低(

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05)，IL-2、IL-10、IFN-γ水平顯著升高(

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05)；與軟肝飲低劑量組比較，軟肝飲高、中劑量組IL-4水平顯著降低(

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05)，IL-10水平顯著升高(

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05)。見表3。

表3 各組小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平比較

4 討論

HBV感染呈世界流行性，會引發全球嚴重的健康問題。近年來，隨著抗病毒藥物的廣泛應用，HBV-DNA得到了有效控制，但距離臨床治愈仍有漫長的路程?，F代諸多研究發現，HBV感染后肝細胞出現損傷并不是由病毒直接引起的，而是由于此種抗原引起宿主的免疫細胞發生免疫應答所致。宿主感染HBV后，各淋巴細胞亞群數目和功能發生改變，這就表明機體外周血淋巴細胞亞群間的平衡被打破，機體的免疫狀態可能發生紊亂。所以，在HBV感染后，宿主將啟動適應性免疫應答和非適應性免疫應答以達到清除病毒的目的。

HBV感染可歸屬于中醫學“脅痛”“黃疸”“積聚”“鼓脹”等疾病范疇。邪氣入侵是其發病的外在因素，正氣不足是發病的內在條件，邪氣主要包括濕熱、疫毒、瘀血等，正氣不足主要是指脾氣虧虛、腎氣不足等，發病過程中常常虛實錯雜。對HBV感染的治療，中醫主張辨證論治，肝氣郁結者應疏肝理氣，肝膽濕熱者應清利濕熱，脾失健運者應益氣健脾，瘀血阻絡者應活血化瘀，肝腎陰虛者則滋腎益肝，脾腎陽虛者應溫補脾腎，其中證型相兼者應將上述治法聯合運用。中醫藥治療慢性乙型病毒性肝炎的作用機制不在于直接殺滅病毒，而是通過發揮中藥方劑的整體效應以調整機體的免疫狀態，從而達到間接殺滅病毒的目的。

慢性肝炎隨著病情進展會經歷肝纖維化至肝硬化，肝纖維化是可逆轉的，早期診治肝纖維化，可以避免肝硬化并發癥的發生。血清“肝纖維化四項”(HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ)是目前臨床上方便可靠的檢測肝纖維化的指標。HA由間質細胞合成，經淋巴入血，由肝竇內皮細胞攝取并降解，當肝臟受損后，HA水平升高。當肝臟發生纖維化后LN會大量沉積在肝竇內皮細胞間隙，降低內皮細胞的通透性，肝纖維化程度越重，則LN水平越高，兩者呈正相關。Ⅳ-C、PCⅢ也是肝纖維化的指標之一。近年來，肝纖維化的研究也成為臨床研究熱點。劉雯等強調中醫藥在肝纖維化的治療中發揮著重要的作用，其團隊通過研究發現恩替卡韋聯合扶正化瘀膠囊有助于提高肝郁血瘀型慢性乙型病毒性肝炎患者HBeAg轉陰率、HBV-DNA快速應答率，并在肝功能改善和抗肝纖維化方面均有較好作用，為中醫藥在肝纖維化治療方面提供了有效證據。

HBV感染后導致慢性乙型病毒性肝炎的發病與機體免疫功能特異性損傷相關。在HBV感染的過程中，多種炎癥因子參與其中，影響著疾病的預后和進展。IL-2是HBV感染過程中重要的炎癥因子之一，既往研究發現，通過有效的保肝抗病毒后，IL-2水平較治療前顯著提高，提示IL-2水平與HBV感染者的結局和預后有關。研究發現，IL-4與HBsAg、DNA和谷氨酸氨基轉移酶呈正相關，免疫清除期患者治療后IL-4水平較治療前明顯下降，提示IL-4參與肝細胞的炎癥、纖維化等過程。IL-10作為一種重要的免疫抑制炎癥因子，在HBV感染的免疫耐受中起著重要作用，當感染HBV后，患者免疫功能紊亂，導致T細胞刺激后產生大量的IL-10，從而促進肝細胞出現炎癥、壞死、增生。IFN-γ是由活化的T細胞和自然殺傷細胞產生的，參與介導體內炎癥反應。研究發現，慢性乙型病毒性肝炎患者抗病毒治療過程中，血清IFN-γ水平逐漸升高，且IFN-γ水平與HBV-DNA水平呈負相關，提示IFN-γ水平升高可能與HBV抑制甚至清除積極相關，進一步佐證了IFN-γ可以通過刺激機體免疫應答達到抗病毒的目的。慢性乙型病毒性肝炎的發病多與濕熱瘀毒有關，其中正氣虧虛是發病的基礎，濕熱瘀毒是發病的條件，正氣虧虛、瘀血內結是其病機所在，故創立軟肝飲，旨在益氣健脾、化瘀軟堅。軟肝飲全方由丹參、赤芍、醋鱉甲、黃芪、莪術、柴胡、炒白術、三七、五味子共9味藥物組成。方中丹參、醋鱉甲為君藥，有祛瘀軟堅之功。莪術、三七、赤芍破血行氣化瘀；黃芪、炒白術益氣健脾，柴胡疏肝理氣，五味子益氣生津、補腎寧心，全方共奏活血化瘀、益氣健脾之效。既往臨床研究發現，軟肝飲能明顯改善慢性乙型病毒性肝炎患者乏力、納差、肝區疼痛等不適，降低肝功能異常指數等，同時對特異性免疫指標有一定的影響，發揮協同西藥增強抗病毒作用。實驗研究發現，軟肝飲大、小劑量組可明顯降低人血清白蛋白誘導的免疫性肝纖維化大鼠模型血清HA、LN、PCⅢ的含量，同時可降低大鼠肝臟中羥脯氨酸的含量，從而證實軟肝飲通過對肝臟膠原物質代謝的影響而產生抗肝纖維化的治療作用。近年來的動物實驗研究表明，中藥軟肝飲高劑量能夠明顯降低HBV轉基因小鼠血清學生化指標谷氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶、總膽紅素的水平。

本次研究結果顯示，治療后軟肝飲高劑量組及恩替卡韋組HBV轉基因小鼠血清和肝組織中HBV-DNA含量明顯降低，治療后軟肝飲高劑量組和恩替卡韋組LN、HA、Ⅳ-C水平低于模型組；HBV轉基因小鼠模型組IL-2、IL-10、IFN-γ水平明顯降低，而IL-4水平明顯升高，治療后軟肝飲高、中劑量組以及恩替卡韋組IL-10水平明顯升高，IL-4水平明顯降低。結果表明，軟肝飲治療HBV轉基因小鼠發揮抗病毒及抗纖維化的作用機制可能與調控炎癥細胞因子有關。