高效液相色譜法測定桔梗多糖對桔梗皂苷D在大鼠體內藥物代謝動力學參數的影響

任蓉蓉，陳青青，張青青，楊 曄，2，3，尹登科，2，3

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.新安醫學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230012；3.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

桔梗為桔梗科植物桔梗[

Platycodon

grandiflorum

(Jacq.)A.DC.]的干燥根，常以“桔梗湯”或“桔梗水提液”給藥，其主要活性成分為三萜皂苷。現代藥理學研究顯示，桔梗具有祛痰止咳、抗腫瘤、抗炎癥、保肝、降糖降脂和調節免疫等多種藥理活性，其中桔梗皂苷D(platycodin D，PD)被認為是主要的有效成分。但PD口服生物利用度低，相關的體內藥物代謝動力學研究也較少。“桔梗湯”或“桔梗水提液”在水煎煮過程中使桔梗多糖(

Platycodon

grandiflorum

polysaccharides，PGP)成分溶出，PGP與小分子活性成分PD一同服下。目前關于桔梗的研究主要集中在其小分子活性成分PD，對于PGP主要集中在提取、抗氧化等方面，很少有研究關注PGP是否在“桔梗湯”或“桔梗水提液”發揮藥效時起到一定作用。本研究通過大鼠灌胃模型，探究PGP對PD口服吸收過程中可能產生的影響。本研究對于探討多糖與小分子的協同作用以及提高藥物療效和安全性，指導新藥開發均具有重要意義。

1 材料與試劑

1.1 藥品與試劑 PGP(批號DST191105-178，純度≥98.0%)、PD(批號DST191103-015，純度≥98.0%)：成都德思特生物技術有限公司；水為超純水；乙腈、甲醇(色譜純)：瑞典Oceanpak公司；其余試劑(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗動物及分組 健康SD大鼠24只，SPF級，雌雄各半，體質量(200±25)g，由安徽醫科大學實驗動物中心[生產許可證號：SCXK(皖)2017—001]提供。常規飼養，自由飲食飲水，飼養環境溫度為18～26 ℃，相對濕度為(55±5)%，研究所涉及的動物實驗經安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準。大鼠實驗前禁食12 h，可自由飲水。將實驗大鼠隨機分為PD組，PD+PGP低、中、高劑量組(PD-PGP-L、PD-PGP-M、PD-PGP-H組)，每組6只。

1.3 儀器 Vortex-genie渦旋混合器：美國Scientific Industries；Milli-Q超純水器：美國Millipore公司；Centrifuge臺式高速離心機：上海東兢電子有限公司；BP212D型電子天平：德國Sartorius公司；LC-20ADXR液相色譜儀：日本島津公司。

2 方法與結果

2.1 方法學考察

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB C色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(25∶75，

V/V

)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：206 nm。

2.1.2 標準添加對照品的制備 精密稱取PD對照品10.0 mg，以甲醇溶解并定容至10 mL，得質量濃度為1.0 mg/mL的對照品儲備液。精密吸取上述儲備液10 μL，加入100 μL空白大鼠血漿中，加入甲醇400 μL，渦旋除蛋白5 min，15 000 r/min離心15 min，取上清，置氮氣干燥儀下揮去溶劑，殘渣加100 μL乙腈復溶，即得。供試品溶液的制備方法：精密吸取含藥血漿100 μL，自“加入甲醇”起，按照標準添加溶液對照品制備方法處理樣品，即得。

2.1.3 專屬性考察 分別考察大鼠空白血漿、空白血漿加PGP、空白血漿加PD對照品以及PD-PGP-H組給藥30 min后大鼠血漿樣品，每組6份，按照“2.1.2”項下血漿樣品處理操作，得到相應的色譜圖(見圖1)。結果表明，PD保留時間為8.53 min，血漿中內源性物質對PD的測定無干擾。

圖1 空白血漿(A)、PGP血漿樣品(B)、PD對照品血漿樣品(C)、PD-PGP-H組含藥血漿樣品(D)色譜圖

2.1.4 定量限確定 取100 μL空白血漿，加入PD對照品溶液，按“2.1.2”項下血漿樣品處理方法進行操作。當色譜峰信噪比(S/N)=10時，得定量限為5 μg/mL(準確度為95.53%，RSD=3.05%，

n

=6)；當色譜峰的S/N=3時，最低檢測限為2 μg/mL。2.1.5 標準曲線及線性范圍確定 取標準品儲備液，以空白大鼠血漿配制濃度分別為0、5、10、20、40、80、100 μg/mL的PD標準血漿樣品，按照“2.1.2”項下血漿樣品處理操作，以樣品濃度(

ρ

)為橫坐標，樣品的峰面積(

A

)為縱坐標，最小二乘法計算回歸方程。測得回歸方程為

A

=10 906

ρ

-5 534

.

8(

r

=0

.

999 3)，說明PD在5～100 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.1.6 回收率考察 精密移取空白血漿100 μL，分別加入低、中、高3種濃度(5、50、100 μg/mL)的PD溶液各10 μL，各濃度樣品平行6組，按“2.1.2”項下血漿樣品處理操作，10 μL進樣分析。經計算，PD低、中、高3個濃度樣品的回收率分別為(103.60±2.60)%、(96.33±2.29)%、(100.74±2.10)%，RSD分別為2.51%、2.38%、2.09%，符合生物樣品分析原則要求的回收率。

2.1.7 日內及日間精密度考察 精密移取空白血漿100 μL，分別加入低、中、高3種濃度的PD溶液(5、50、100 μg/mL)各10 μL，各濃度樣品平行5組，按“2.1.2”項下血漿樣品處理操作，10 μL進樣分析。3種濃度溶液均1日內重復進樣6次，測定日內精密度，連續進樣6 d，測定日間精密度。實驗結果顯示，低、中、高3種濃度PD溶液的日內精密度RSD分別為3.10%、2.94%、2.41%，日間精密度RSD分別為2.23%、2.81%、2.34%，符合生物樣品分析原則要求。

2.1.8 穩定性實驗 精密移取空白血漿100 μL，加入低、中、高3種濃度(5、50、100 μg/mL)的PD溶液各10 μL，各濃度樣品平行5組，按“2.1.2”項下血漿樣品處理操作，分別進行室溫長期放置、反復凍融3次和-20 ℃冰箱凍存2周后，10 μL進樣分析，并考察穩定性。結果顯示低、中、高3種濃度穩定性的RSD分別為3.62%、4.31%、1.43%，結果表明PD在上述條件下穩定性良好，符合生物樣品分析原則。

2.2 動物實驗 PD組灌胃液的制備：精密稱取PD，用生理鹽水溶解并定容，得2 mg/mL的PD灌胃溶液。另精密稱取3種不同質量的PGP，溶解于上述PD溶液中，調節PGP濃度至2、4、8 mg/mL，即得PD-PGP-L組、PD-PGP-M組、PD-PGP-H組灌胃液。大鼠的灌胃容積為10 mL/kg。PD組只灌胃2 mg/mL的PD，PD-PGP-L、PD-PGP-M與PD-PGP-H組分別灌胃2 mg/mL的PD和2、4、8 mg/mL的PGP。給藥后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、360 min，從眼眥取血0.5 mL，置于經肝素處理的EP管中，3 000 r/min離心10 min，收集血漿。

2.4 PD血藥濃度-時間曲線 大鼠單劑量灌胃PD或PD+PGP所得的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

圖2 PD在大鼠體內血藥濃度-時間曲線

2.5 灌胃PD的主要藥物代謝動力學參數 將計算所得的血藥濃度-時間數據，采用DAS 2.1軟件進行擬合(二室模型，權重系數為1)，進而計算藥物代謝動力學參數(見表1)。結果表明，PD+PGP灌胃后大鼠體內的藥物代謝動力學參數發生了顯著改變。與PD組相比，各PD-PGP實驗組PD的達峰時間均顯著縮短，峰濃度均顯著提高，血藥濃度-時間曲線下面積顯著增加(

P

<0

.

05)。此外，PD-PGP-M組的清除率顯著減小(

P

<0

.

05)。

表1 PGP對PD藥物代謝動力學參數的影響

3 討論

中藥大多采用水煎煮口服的給藥方式，可溶性多糖可在水煎煮過程中溶解在湯劑中。多糖大分子的生理藥理活性近年來受到了越來越多的關注，被發現具有免疫調節、抗腫瘤、延緩衰老、降血糖、抗病毒、抗炎等多種生物活性。當桔梗以水煎煮(桔梗湯或桔梗水提液)口服的給藥方式，可溶性多糖在中藥水煎液中與小分子活性成分PD一同服下進入胃腸道。由于人體缺乏多糖水解酶，大部分多糖不能被人體直接消化和吸收。研究證實，中藥多糖被作為腸道菌群代謝底物，與腸道菌群相互作用時產生一些其他的生物活性物質對藥物的體內過程產生影響。此外，研究證實，PGP可以誘導T細胞以及巨噬細胞的增殖，顯著促進相關細胞因子的分泌。細胞因子的產生會對腸上皮的通透性產生影響，進而影響藥物在體內的代謝。本研究結果顯示，PGP能夠顯著縮短PD的達峰時間，顯著減小清除率，提高最大藥物濃度以及增大血藥濃度-時間曲線下面積。由此推測，PGP與小分子活性物質PD一同服下后，一方面可能與腸道菌群發生相互作用，另一方面可能直接影響相關效應因子的分泌，進而對PD的體內藥物代謝動力學參數產生影響。PGP影響PD在大鼠體內藥物代謝動力學參數的具體機制將是下一步研究的方向和重點內容。