大孔樹脂聯(lián)合Sephadex LH-20葡聚糖凝膠純化蜂膠總黃酮工藝研究

李 治，湯毛毛，李 景，常相偉，2，3，4，劉勁松，彭代銀，5，王國(guó)凱，桂雙英，2，3，4

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012；4.安徽省教育廳現(xiàn)代藥物制劑工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230012；5.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

蜂膠為蜜蜂科昆蟲意大利蜂(

Apis

mellifera

L.)工蜂采集的植物樹脂與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的黏性固體膠狀物。現(xiàn)代研究表明，蜂膠中含有黃酮類、萜烯類、酚酸類、芳香醛類及氨基酸、酶、礦物質(zhì)等多種成分，其中黃酮類化合物是主要活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、降血糖等廣泛的藥理作用。關(guān)于蜂膠黃酮類成分的提取研究較多，主要有溶劑浸提法、超聲提取法、微波提取法及超臨界萃取法等，但提取液中蜂膠總黃酮純度較低，難以直接應(yīng)用，需要進(jìn)一步純化。大孔吸附樹脂是一種廣泛應(yīng)用的吸附分離材料，文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)黃酮類成分具有較好的選擇吸附性。本實(shí)驗(yàn)采用大孔吸附樹脂和Sephadex LH-20葡聚糖凝膠聯(lián)用分離純化蜂膠總黃酮，為蜂膠總黃酮的進(jìn)一步研究與開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

紫外可見分光光度計(jì)(型號(hào) UV-8000)：上海元析儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；真空干燥箱(型號(hào) DZF-250)：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；液晶超聲波清洗器(型號(hào) KS-250DE)：昆山潔力美超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號(hào) R-300)：瑞士BUCHI公司。

蜂膠(批號(hào) FJ20190213)：安徽績(jī)溪五蜂園蜂業(yè)有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)彭華勝教授鑒定為中國(guó)蜂膠；HPD-100、HPD-500、HPD-600、HPD-722、HPD-826、AB-8、ADS-17、NKA-9、D101型大孔吸附樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(批號(hào) 413B052)：上海索萊寶生物科技有限公司；蘆丁對(duì)照品(批號(hào) Y24F11Y17051，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、楊梅素對(duì)照品(批號(hào) YM0311YA13，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)：上海源葉生物科技有限公司；白楊黃素對(duì)照品(批號(hào) C93335CCK0，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%)、芹菜素對(duì)照品(批號(hào) A90650IFP1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、山奈酚(批號(hào) J70002JBY1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、高良姜素(批號(hào) G01300IGP1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)：天津希恩思生化科技有限公司；喬松素(批號(hào) CFS201802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)：Chem Faces公司；槲皮素(批號(hào) C10623828，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%)：上海麥克林生化科技有限公司；水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 蜂膠總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取蘆丁對(duì)照品10.14 mg，置50 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度為0.202 8 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的配制 取蜂膠粉末(過(guò)3號(hào)篩)1.0 g，精密稱定，用25 mL 95%乙醇超聲(頻率：40 kHz，功率：100 W)提取30 min，過(guò)濾，取續(xù)濾液，備用。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加95%乙醇至總?cè)莘e為15 mL，依次加入硝酸鋁溶液、醋酸鉀溶液各1 mL，搖勻，加水至刻度，搖勻，靜置1 h。于415 nm處，以30%乙醇為空白試劑調(diào)零，415 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(A)，繪制吸光度值與蘆丁濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

Y

=25

.

379

X

+0

.

018 5，

R

=0

.

999 5，結(jié)果表明蘆丁在0.004～0.024 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.2 上樣液的制備 取蜂膠粉末(過(guò)3號(hào)篩)約45 g，精密稱定，加入25倍量95%乙醇，超聲提取30 min，過(guò)濾，濾液減壓回收溶劑，濃縮至無(wú)醇味，用20%乙醇復(fù)溶至1 000 mL，上樣液中蜂膠總黃酮濃度為1.25 mg/mL。

2.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 將9種不同型號(hào)的大孔樹脂分別浸泡在95%乙醇中24 h，充分溶脹后裝柱，用95%乙醇沖洗，直至流出液澄清、蒸干后無(wú)殘留物為止，再用大量超純水沖洗至無(wú)醇味，備用。

2.4 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

2.4.1 大孔吸附樹脂的篩選 精密稱定D101、HPD-100、AB-8、HPD-722、ADS-17、HPD-826、NKA-9、HPD-500、HPD-600型大孔樹脂各2.0 g(濕質(zhì)量)，置于100 mL錐形瓶中，加入濃度為1.25 mg/mL的上樣液50 mL，25 ℃恒溫振蕩24 h，振蕩頻率為100 r/min，濾過(guò)，取續(xù)濾液測(cè)定，計(jì)算各樹脂在25 ℃下對(duì)蜂膠總黃酮的吸附量和吸附率。將上述吸附飽和的大孔樹脂用超純水清洗后，分別加入95%乙醇50 mL，25 ℃恒溫振蕩12 h進(jìn)行靜態(tài)解吸，濾過(guò)，取續(xù)濾液測(cè)定，計(jì)算解吸率。結(jié)果見表1。

表1 不同類型大孔樹脂對(duì)蜂膠總黃酮的靜態(tài)吸附量及吸附率

由表1可知，HPD-722和HPD-600型大孔樹脂對(duì)蜂膠總黃酮的吸附能力較強(qiáng)；而HPD-722型大孔樹脂對(duì)蜂膠總黃酮的解吸能力強(qiáng)于HPD-600，因此選擇HPD-722型樹脂用于蜂膠總黃酮的分離純化。

2.4.2 靜態(tài)吸附曲線的繪制 取HPD-722型大孔樹脂約1 g(濕質(zhì)量)，精密稱定，共24份，分別置50 mL錐形瓶中，加入濃度為1.25 mg/mL的上樣液20 mL，在25 ℃條件下以100 r/min的速率振蕩24 h，每隔1 h取出一個(gè)錐形瓶，測(cè)定其濃度，繪制靜態(tài)吸附曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 HPD-722型大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附曲線

在0～9 h間，樹脂對(duì)蜂膠總黃酮的吸附量隨著時(shí)間增加而增加，在9 h以后，樹脂的吸附量趨于平衡，吸附率達(dá)81.13%，提示HPD-722型大孔樹脂對(duì)蜂膠總黃酮吸附9 h時(shí)基本達(dá)到吸附飽和。

2.5 動(dòng)態(tài)吸附行為的考察

2.5.1 泄露曲線的繪制 取HPD-722大孔樹脂約10 g(濕質(zhì)量)，精密稱定，裝入層析柱(2 cm×30 cm)，室溫下將濃度為1.25 mg/mL的上樣液，以1.0 mL/min加入樹脂柱中，流出液每5 mL收集一份，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，并繪制泄露曲線。當(dāng)流出液濃度為上樣液濃度的1/10時(shí)，到達(dá)泄露點(diǎn)，認(rèn)為此時(shí)為最佳上樣容積。由圖2可見，在第19份流出液中濃度為0.126 mg/mL，達(dá)到上樣液濃度的1/10，因此選擇上樣液容積為95 mL。

圖2 蜂膠總黃酮在HPD-722大孔樹脂上的泄露曲線

2.5.2 上樣液濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附性能的影響 取HPD-722大孔樹脂約10 g(濕質(zhì)量)，精密稱定，共5份，緩慢裝入層析柱(2 cm×30 cm)中，徑高比為1∶9，配制濃度分別為0.33、0.68、1.34、2.47、4.64 mg/mL的上樣液各95 mL，以每小時(shí)2倍床體積(bed volume，BV)上樣，考察最佳上樣濃度。結(jié)果各上樣濃度下的吸附率分別為95.89%、95.16%、93.28%、92.15%、85.81%，結(jié)果表明,當(dāng)上樣液濃度為2.47 mg/mL時(shí)，樹脂吸附得較為飽和，吸附率也較高，因此選擇上樣液濃度為2.47 mg/mL。

2.5.3 上樣容積流量對(duì)動(dòng)態(tài)吸附性能的影響 取HPD-722型大孔樹脂約10 g(濕質(zhì)量)，精密稱定，共4份，緩慢裝入層析柱(2 cm×30 cm)中，徑高比為1∶9，以濃度為2.47 mg/mL的上樣液95 mL分別以每小時(shí)1、2、3、4 BV上樣，考察最佳上樣容積流量。結(jié)果各上樣容積流量下的吸附率分別為92.08%、92.94%、80.47%、67.82%，結(jié)果表明,當(dāng)上樣容積流量為每小時(shí)2 BV時(shí)，總黃酮的吸附率較高，因此選擇上樣容積流量為每小時(shí)2 BV。

2.5.4 徑高比對(duì)動(dòng)態(tài)吸附性能的影響 取HPD-722型大孔樹脂約10 g(濕質(zhì)量)，精密稱定，共4份，緩慢裝入徑高比為1∶2、1∶4、1∶9、1∶12的層析柱中，將濃度為2.47 mg/mL的上樣液95 mL以每小時(shí)2 BV上樣，考察最佳徑高比，結(jié)果各徑高比下的吸附率分別為84.87%、90.09%、93.32%、93.56%，結(jié)果表明當(dāng)徑高比為1∶9時(shí)，吸附率增加趨于平緩，因此確定最佳徑高比為1∶9。

2.5.5 洗脫劑容積分?jǐn)?shù)對(duì)HPD-722型大孔樹脂洗脫蜂膠總黃酮效果的影響 取HPD-722型大孔樹脂約10 g(濕質(zhì)量)，精密稱定，緩慢裝入層析柱(2 cm×30 cm)中，徑高比為1∶9，將濃度為2.47 mg/mL的上樣液95 mL以每小時(shí)2 BV上樣，待吸附飽和后，依次用超純水及10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液各2 BV梯度洗脫，考察最佳洗脫劑容積分?jǐn)?shù)。結(jié)果各部分洗脫率分別為0、0、0.21%、2.89%、12.53%、31.24%、26.49%、15.83%、6.61%、3.58%、2.45%。結(jié)果表明超純水和10%乙醇幾乎沒(méi)有洗脫下總黃酮，用超純水洗脫時(shí)，用Fehling試劑檢測(cè)顯陰性，即用純水洗脫時(shí)無(wú)水溶性單糖被洗脫下。20%、30%乙醇洗脫液中總黃酮含量很低，40%～70%乙醇洗脫液中總黃酮含量較高，而80%～95%乙醇洗脫液中也含有少量總黃酮，故確定80%乙醇為洗脫溶劑。

2.5.6 洗脫劑用量對(duì)洗脫效果的影響 取HPD-722型大孔吸附樹脂約10 g(濕質(zhì)量)，精密稱定，按“2.5.5”項(xiàng)下方法上樣除雜，再用80%乙醇溶液120 mL(8 BV)以每小時(shí)2 BV洗脫，考察最佳洗脫劑用量。結(jié)果洗脫劑用量為1、2、3、4、5、6、7、8 BV的洗脫率分別為28.15%、69.21%、78.53%、83.76%、85.01%、85.84%、86.36%。當(dāng)洗脫劑用量為1、2 BV時(shí)，總黃酮洗脫率分別為28.15%和41.06%；當(dāng)洗脫劑用量為3、4 BV時(shí)，總黃酮洗脫率分別為9.32%和5.23%。結(jié)果表明此時(shí)樹脂上吸附的黃酮類成分已基本洗脫完全，因此確定洗脫劑用量為4 BV。

2.5.7 洗脫劑容積流量對(duì)洗脫效果的影響 取HPD-722型大孔樹脂約10 g(濕質(zhì)量)，精密稱定，共4份，按“2.5.5”項(xiàng)下方法上樣除雜，再用80%乙醇溶液60 mL(4 BV)分別按每小時(shí)1、2、3、4 BV洗脫，考察最佳洗脫劑容積流量。結(jié)果各洗脫容積流量下的洗脫率分別為89.12%、86.76%、83.24%、72.41%。蜂膠總黃酮的洗脫率隨著洗脫容積流量的增加而減少，故確定洗脫劑容積流量為每小時(shí)1 BV。

2.5.8 大孔樹脂最佳純化工藝及驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，確定純化蜂膠總黃酮的最佳工藝條件為選用HPD-722型大孔樹脂，比上樣量為0.43 g/g(藥材/濕樹脂)，上樣液濃度為2.5 mg/mL，上樣容積為95 mL，上樣容積流量為2 BV/h，徑高比為1∶9，洗脫時(shí)先以30%乙醇3 BV除雜，再用80%乙醇4 BV洗脫，洗脫容積流量為每小時(shí)1 BV。

采用大孔樹脂最佳純化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，80%乙醇的平均洗脫率為87.46%，固形物由1.15 g減少到0.452 g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)從20.65%升至平均41.42%(RSD=2.28%)，表明建立的純化工藝對(duì)蜂膠中黃酮類成分有較好的分離純化效果。

表2 大孔樹脂純化工藝驗(yàn)證結(jié)果

2.6 Sephadex LH-20純化蜂膠總黃酮的工藝研究

2.6.1 洗脫劑容積分?jǐn)?shù)對(duì)Sephadex LH-20純化蜂膠總黃酮效果的影響 稱取適量葡聚糖凝膠，甲醇溶脹24 h后，裝入2.5 cm×180 cm層析柱中，柱容積為500 mL。取經(jīng)大孔樹脂純化后的蜂膠總黃酮Ⅰ(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：41.42%)1.2 g，精密稱定，用少量甲醇超聲溶解后，上樣于Sephadex LH-20層析柱，分別以100%、90%、80%、70%甲醇洗脫，洗脫流速為1 mL/min，每10 min收集一個(gè)流份。各流份分別點(diǎn)樣于聚酰胺薄膜，以三氯化鋁為顯色劑，于紫外365 nm下與蜂膠中主要黃酮單體對(duì)照品(高良姜素、槲皮素、蘆丁、楊梅素、芹菜素、白楊素、松屬素、山奈酚)點(diǎn)樣后進(jìn)行比對(duì)，將紫外燈下顯現(xiàn)相同顏色的流份進(jìn)行合并，濃縮，干燥，得蜂膠總黃酮Ⅱ。取蜂膠總黃酮Ⅱ適量，按“2.1”項(xiàng)下方法，計(jì)算蜂膠總黃酮Ⅱ的純度及回收率，結(jié)果見表3。由表3可知，隨著洗脫劑甲醇容積分?jǐn)?shù)的降低，蜂膠總黃酮純度和回收率均呈降低趨勢(shì)，因此選擇100%甲醇作為洗脫劑。

表3 不同洗脫劑容積分?jǐn)?shù)下蜂膠總黃酮純度及回收率

2.6.2 洗脫劑容積流量對(duì)Sephadex LH-20純化蜂膠總黃酮效果的影響 取經(jīng)大孔樹脂純化后的蜂膠總黃酮Ⅰ(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：41.42%)1.2 g，精密稱定，用少量甲醇超聲溶解后，上樣于Sephadex LH-20層析柱，以甲醇洗脫，洗脫流速分別為0.50、0.75、1.00、1.25 mL/min，其他工藝同“2.6.1”，取蜂膠總黃酮Ⅱ適量，按“2.1”項(xiàng)下方法，計(jì)算蜂膠總黃酮Ⅱ的純度及回收率，結(jié)果見表4。由表4可知，蜂膠總黃酮的純度和回收率都隨著洗脫劑容積流量的增加而降低，因此選擇洗脫容積流量為0.75 mL/min。

表4 不同洗脫劑容積流量下蜂膠總黃酮純度及回收率

2.6.3 Sephadex LH-20最佳純化工藝及驗(yàn)證試驗(yàn) 據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳工藝條件為取經(jīng)大孔樹脂純化后的蜂膠總黃酮Ⅰ1.2 g，精密稱定，用少量甲醇超聲溶解后上樣于Sephadex LH-20層析柱，以甲醇洗脫，洗脫流速為0.75 mL/min，7.5 mL作為一個(gè)流份收集。各流份點(diǎn)樣于聚酰胺薄膜，以三氯化鋁為顯色劑，于紫外365 nm下與蜂膠中主要黃酮單體對(duì)照品點(diǎn)樣后進(jìn)行比對(duì)，將紫外燈下顯現(xiàn)相同顏色的流份進(jìn)行合并，濃縮，干燥，得蜂膠總黃酮Ⅱ。

取4份經(jīng)大孔樹脂純化后的蜂膠總黃酮Ⅰ(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：41.42%)約1.2 g，精密稱定，按Sephadex LH-20最優(yōu)工藝進(jìn)行純化，結(jié)果見表5。由驗(yàn)證結(jié)果可知，經(jīng)Sephadex LH-20柱層析后，固形物由452 mg減少到平均162 mg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)從41.42%升至平均68.48%(RSD=2.05%)；平均回收率為59.1%(RSD=1.05%)，表明經(jīng)Sephadex LH-20柱層析后，蜂膠總黃酮純度可以進(jìn)一步提高。

表5 純化工藝驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

大孔樹脂是一類由有機(jī)高分子聚合物構(gòu)成的吸附材料，具有穩(wěn)定性高、吸附選擇性強(qiáng)、解吸條件溫和、易于再生等優(yōu)點(diǎn)，這種方法提取率較高、成本較低，因而適合用于工業(yè)化生產(chǎn)，目前已較多地用于黃酮類化合物的分離純化。Sephadex LH-20型葡聚糖凝膠適用于分離有機(jī)溶劑中的親脂性化合物，其分離效果好，可再生利用，因而常用于中藥有效成分的分離。

本研究前期參考相關(guān)文獻(xiàn)及適用于分離純化黃酮類成分的各類型樹脂，從而選擇了此9種型號(hào)的大孔吸附樹脂進(jìn)行篩選。由于蜂膠中含有的脂溶性成分較多，幾乎不溶于水，難以用水對(duì)蜂膠中的有效成分進(jìn)行提取，而多以乙醇為溶劑。由于大孔吸附樹脂在蜂膠乙醇提取液中對(duì)黃酮類成分幾乎不吸附，因此本研究參考了相關(guān)文獻(xiàn)，并根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以醇提水沉法制備蜂膠大孔樹脂上樣液，確定最終上樣液乙醇濃度為20%。此方法制備的上樣液上樣于大孔樹脂柱中，蜂膠總黃酮吸附率較高，適用于大孔樹脂較為充分地富集蜂膠中的黃酮類成分。

Sephadex LH-20型葡聚糖凝膠對(duì)分離黃酮類化合物效果較好，已較為廣泛地應(yīng)用。在使用時(shí)，應(yīng)盡量增加柱長(zhǎng)，調(diào)緩洗脫流速至每滴3～4 s，以達(dá)到較好的分離純化效果。

本實(shí)驗(yàn)制備得到的蜂膠總黃酮固形物由1.15 g減少到0.268 g，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)從20.65%提高到68.48%，表明HPD-722型大孔吸附樹脂聯(lián)合Sephadex LH-20型葡聚糖凝膠可有效純化富集蜂膠中的黃酮類成分，該工藝可以為蜂膠總黃酮及其原藥材的研究與開發(fā)提供參考。