FAM19A4甲基化檢測在HR-HPV陽性宮頸癌及其癌前病變評估中的臨床價值

劉 雙,王亞男

湖南省婦幼保健院婦產科,湖南長沙 410008

宮頸癌是危害女性健康的主要生殖系統惡性腫瘤之一，其病死率可達50%[1]，因此對宮頸癌進行早發現早干預具有重要的臨床實踐意義。高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染是宮頸癌發生、發展的危險因素，但是從HR-HPV感染到成為宮頸癌是一個多基因、多因素共同作用的過程[2]。而目前，宮頸癌的早期篩查方法及標志物比較缺乏，因此尋找一種特異性的分子標志物對宮頸癌及其癌前病變進行早期識別具有重要意義。FAM19A4是TAFA基因家族成員，已經有研究證實，FAM19A4甲基化與宮頸癌及其癌前病變存在密切關系，有望成為一種新型的宮頸癌早期篩查標志物[3]。但是目前，關于FAM19A4甲基化與不同基因型人乳頭瘤病毒(HPV)感染宮頸癌相關性方面的研究報道比較少見。基于此，本研究將通過探討FAM19A4甲基化檢測在HR-HPV陽性宮頸癌及其癌前病變評估中的臨床價值，以期為宮頸癌的早期防控提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 連續性納入2020年1-12月本院收治的80例宮頸癌患者作為宮頸癌組，年齡30～70歲，平均(47.55±8.43)歲；以90例宮頸癌前病變患者作為癌前病變組，年齡28～70歲，平均(45.20±6.91)歲；以同期的80例健康體檢者作為對照組，年齡20～60歲，平均(42.19±5.57)歲。3組研究對象的年齡比較差異無統計學意義(P<0.05)。病例入選標準：(1)所有患者均在陰道鏡下經宮頸組織病理學確診分組，且經兩位高級職稱病理科醫生核實，宮頸癌按2018年FIGO指南分期[4]；(2)癌前病變符合《2019 ASCCP宮頸癌篩查和癌前病變管理指南共識》[5]中的相關診斷標準；(3)納入研究前未進行相關藥物治療及手術；(4)患者年齡≥18歲。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤;(2)伴有其他宮頸疾病或并發癥；(3)先天性子宮發育不良；(4)臨床、影像及病理資料不完整；(5)診療依從性比較差。本研究經過醫院醫學倫理委員會的審批，患者或家屬均知情并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1HPV的篩查及基因分型 采集宮頸脫落細胞保存于采集瓶中，保存條件4 ℃。標本采集前72 h禁止性行為、陰道用藥及沖洗。采用雜交捕獲法進行HPV的篩查及基因分型，該方法能夠檢出13種HR-HPV。

1.2.2DNA提取 利用TIANamp GenomicDNA提取試劑盒提取HR-HPV陽性者的宮頸脫落細胞標本中的DNA，按試劑盒說明書操作。立即使用紫外分光光度計對以上提取的DNA進行濃度測量。

1.2.3重亞硫酸鹽修飾 取HR-HPV陽性者的宮頸脫落細胞標本進行DNA的提取，然后按照試劑盒說明書要求進行重亞硫酸鹽修飾(EZ DNA甲基化試劑盒-DIRECT由Zymo Research公司提供)；加入900 μL ddH2O和300 μL M-Dilution Buffer和50 μL M-Dissolving S Buffer到CT Conversion Reagent干粉中，充分混勻，室溫下漩渦振蕩10 min；將DNA 標本加入PCR管中，130 μL CT Conversion Reagent，充分混勻。反轉錄反應條件如下：98 ℃，10 min；64 ℃，30 min；4 ℃保存最長20 h；上述制備的重亞硫酸鹽修飾后 DNA 使用 Quawell Q5000 紫外分光光度計進行濃度測量，立即用于PCR檢測。

1.2.4熒光定量PCR 以ACTB作為內參基因進行PCR擴增，擴增引物見表1。擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火20 s及65 ℃延伸40 s，共40個循環。每個標本均重復試驗3次。擴增結果通過采集熒光信號，得到循環閾值(Ct值)及ACTB和FAM19A4的擴增曲線。所有樣品的CtACTB值均< 32，以保證樣品質量，CtFAM19A4值>40的標本被認為代表陰性檢測結果，CtFAM19A4值<40的標本計算甲基化評分，計算公式：2(CtACTB -CtFAM19A4)×100。擴增曲線目標基因越早擴增，甲基化評分越高，表示基因甲基化水平越高。

表1 擴增引物序列

2 結 果

2.13組HR-HPV檢出率的比較 宮頸癌組、癌前病變組及對照組的HR-HPV陽性率分別為92.50%(74/80)、55.56%(50/90)及7.50%(6/80)，差異有統計學意義(P<0.05)。3組HR-HPV陽性者中HPV16/18的感染率分別為66.22%(49/74)、56.00%(28/50)及16.67%(1/6)。

2.23組HR-HPV陽性者FAM19A4基因甲基化檢出率的比較 宮頸癌組FAM19A4基因甲基化檢出率最高,對照組檢出率最低，組間差異具有統計學意義(P<0.05)。采用 Cochran-Armitage趨勢檢驗發現宮頸病變程度與FAM19A4甲基化之間存在線性趨勢(P<0.05)，即隨著宮頸病變嚴重程度增加，FAM19A4基因甲基化的檢出率逐漸升高。見表2。

表2 3組HR-HPV陽性者FAM19A4基因甲基化檢出率的比較

2.3HR-HPV感染的類型與FAM19A4基因甲基化檢出率的關系 HR-HPV陽性者的宮頸脫落細胞中，宮頸癌組HPV16/18陽性者的FAM19A4基因甲基化檢出率(100.00%)高于非HPV16/18陽性者(92.00%)，差異有統計學意義(P<0.05)；癌前病變組中HPV16/18陽性者的FAM19A4甲基化檢出率(75.00%)高于非HPV16/18陽性者(68.18%)，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 HR-HPV感染的類型與FAM19A4基因甲基化檢出率的關系

3 討 論

宮頸癌對女性的生命健康產生嚴重影響。HPV基因分型和液基薄層細胞學檢查(TCT)是目前臨床對宮頸癌進行篩查的主要手段，但是TCT的靈敏度比較低，容易產生假陰性，HPV基因分型與TCT聯合檢測的靈敏度雖然得到了提高，但是特異性并沒有得到改善[6]。有研究證實，降低或者清除HPV感染能夠對宮頸癌起到有效的防治作用，但是目前還沒有治療HPV感染的特效方法[7]。本研究對宮頸癌患者、宮頸癌前病變患者及健康體檢者中的HR-HPV陽性率進行了篩查，結果顯示：宮頸癌患者的HR-HPV陽性率(92.50%)最高，其次是宮頸癌前病變患者(55.56%)、健康體檢者(7.50%)，具有明顯差異，與以往研究的報道一致[8]。說明HR-HPV感染對宮頸癌及其癌前病變的早期篩查具有重要意義。

單純的HR-HPV感染并不足以導致宮頸上皮細胞發生惡變，表觀遺傳學發生改變能夠對宮頸癌的發生、發展產生影響[9]。FAM19A4是一種分泌蛋白，在正常組織中呈低水平表達，在單核細胞及巨噬細胞中呈高水平表達，能夠對巨噬細胞的吞噬及遷移起到促進作用，對炎癥及應激反應起到調控作用[10]。有研究顯示，宮頸癌組織中FAM19A4甲基化的檢出率明顯高于正常組織[11]。多項研究證實，FAM19A4甲基化在宮頸癌的發生、發展中具有重要作用[12-13]。本研究通過檢測HR-HPV陽性患者宮頸脫落細胞標本中的 FAM19A4甲基化，結果顯示隨著宮頸病變嚴重程度增加，FAM19A4甲基化檢出率升高。本研究還發現HR-HPV陽性宮頸癌患者中HPV16/18陽性者的FAM19A4基因甲基化檢出率高于非HPV16/18陽性者(P<0.05)，在癌前病變組該差異無統計學意義可能與樣本量小有關。目前，關于HPV感染與宮頸癌基因異常甲基化之間的相關性還不夠清楚；有研究顯示，HR-HPV的E6/E7基因能夠促進DNA甲基轉移酶1的表達，對E6基因進行敲除后DNA甲基轉移酶1的表達也降低[14-15]；在轉染了HPV16/18的細胞中，DNA甲基轉移酶1與DNA甲基轉移酶3b均呈高水平的表達[16]。由此，本研究可以認為宮頸癌及其癌前病變組織中FAM19A4甲基化的改變，可能與 HPV16/18誘導的表觀遺傳重新編程有關。

綜上所述，FAM19A4 基因可能是宮頸細胞癌變的特異性分子標志物，該基因甲基化可能在宮頸癌的發生、發展中起著一定作用。宮頸脫落細胞FAM19A4基因甲基化檢測可能作為宮頸癌及癌前病變的輔助篩查方法。然而，為了進一步確認其診斷價值，需要進行大樣本量的前瞻性研究。