β-catenin調控LL-37促進銅綠假單胞菌的清除*

傅 強,王偉佳,黃福達,繆麗韶，楊山虹，陳 康

廣東省中山市人民醫院檢驗醫學中心，廣東中山 528403

銅綠假單胞菌為革蘭陰性桿菌，是引起院內感染的常見條件致病菌，可引起多種組織器官的感染，如肺部、皮膚、角膜等[1-2]。臨床上抗菌藥物的使用可以改善患者的病情，然而，隨著抗菌藥物的不合理使用，導致銅綠假單胞菌的耐藥性越發嚴重，致使應用抗菌藥物后不能達到滿意的治療效果[1-2]。因此，如何發揮宿主的能動性、提高免疫防御功能是抗感染免疫的研究熱點。

Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路是進化高度保守的通路，盡管參與該通路的分子眾多，β-catenin是該通路中的核心分子。當Wnt/β-catenin通路未被激活時， β-catenin被降解失活。當Wnt/β-catenin通路被激活后，β-catenin在細胞質中累積并轉移至細胞核促進下游靶基因的轉錄，參與胚胎的發育和多器官的穩態[1,3-4]。有報道顯示，β-catenin可參與病原體的感染過程，且因病原體的種類不同，發揮不同的作用。有研究報道，β-catenin抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)的復制，抑制DNA病毒的感染，抑制傷寒沙門菌的感染[5-7]；另一方面，β-catenin促進Ⅰ型牛皰疹病毒的感染[8]。然而，β-catenin在銅綠假單胞菌感染中的作用還需研究?？咕腖L-37是具有廣譜抗菌作用的多肽，可促進銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等病原體的清除[9-11]。在結腸癌中，β-catenin和LL-37相伴增高[12]。然而β-catenin是否通過調控LL-37來促進銅綠假單胞菌的清除還需進一步研究。

本研究發現，在RAW264.7細胞和骨髓來源巨噬細胞中，β-catenin促進銅綠假單胞菌的清除；同時實驗發現，β-catenin促進LL-37的基因表達；進一步實驗發現LL-37可回復β-catenin介導的細菌清除作用，具體報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞培養 小鼠成纖維細胞株L929和小鼠巨噬細胞樣RAW264.7細胞在含10%胎牛血清的高糖達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)中于37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)條件下培養。L929細胞培養7 d后，收集細胞培養上清液，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min去除細胞碎片，經0.22 μm濾器過濾后分裝，-80 ℃保存備用。L929細胞上清液中富含集落刺激分子，可誘導骨髓細胞分化為巨噬細胞。過表達β-catenin的RAW264.7細胞和對照細胞以1×106個/毫升細胞數鋪入6孔板中，培養過夜，銅綠假單胞菌感染后進行后續細菌平板計數和實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)。

1.2小鼠骨髓來源巨噬細胞分離培養 無特定病原體(SPF)級6周齡雌性C57BL/6小鼠，處死后無菌條件下取股骨和脛骨中的骨髓細胞，制備單細胞懸液，1×107鋪入10 cm培養皿中，置于含5%胎牛血清、10% L929培養上清液的高糖DMEM中培養7 d，誘導成骨髓來源巨噬細胞。用β-catenin慢病毒和對照慢病毒感染骨髓來源巨噬細胞，過表達β-catenin[13]。然后，以5×105個/毫升細胞數鋪入6孔板中，培養過夜，銅綠假單胞菌感染后進行后續細菌平板計數和Real-time PCR。

1.3小RNA干擾實驗 小鼠LL-37的小干擾RNA(siRNA)和小干擾RNA對照(siNC)購于Santa Cruz Biotechnology公司。按照說明書采用陽離子脂質體2000轉染，以5 μmol/L為siRNA的終水平沉默細胞中LL-37，進行后續的細菌清除實驗。

表1 引物序列

1.5細菌清除實驗 RAW264.7細胞和骨髓來源巨噬細胞加入銅綠假單胞菌共孵育1 h后，更換含300 μg/mL 慶大霉素的培養基作用30 min清除胞外菌，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，設置兩個復孔，一個復孔收集1 h細胞懸液，0.1% 曲拉通-X裂解細胞釋放細胞內細菌，平板計數計算1 h菌落數；另一個復孔繼續培養1 h，收集2 h細胞懸液，0.1% 曲拉通-X裂解細胞釋放細胞內細菌，平板計數計算2 h菌落數。細菌清除率=(1 h菌落數-2 h菌落數)/1 h菌落數×100%。

2 結 果

2.1β-catenin促進銅綠假單胞菌的清除 銅綠假單胞菌感染過表達β-catenin的RAW264.7細胞和骨髓來源巨噬細胞后，細菌平板計數檢測細菌清除情況。實驗結果發現，在RAW264.7細胞(圖 1A)和骨髓來源巨噬細胞(圖 1B)中，β-catenin促進細菌的清除，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2銅綠假單胞菌感染時，β-catenin促進LL-37基因的表達 實驗結果發現，在RAW264.7細胞中細菌感染12 h后，β-catenin促進抗菌肽LL-37的表達(圖 2A)；同樣發現，在骨髓來源巨噬細胞細菌感染12 h后，β-catenin促進抗菌肽LL-37的表達(圖2B)。

2.3β-catenin調控LL-37促進銅綠假單胞菌的清除 在過表達β-catenin的RAW264.7細胞和骨髓來源巨噬細胞中，銅綠假單胞菌感染后，采用平板計數的方法檢測細菌清除率。實驗結果發現，過表達β-catenin可在RAW264.7細胞(圖3A)和骨髓來源巨噬細胞(圖3B)中促進細菌清除；實驗結果進一步顯示，LL-37可在RAW264.7細胞(圖3A)和骨髓來源巨噬細胞(圖3B)中回復β-catenin的殺菌作用。

注：*P<0.05，**P<0.01;A為RAW264.7細胞；B為骨髓來源巨噬細胞。

注：*P<0.05，**P<0.01;0 h和12 h分別表示銅綠假單胞菌未感染及感染后12 h;A為RAW264.7細胞；B為骨髓來源巨噬細胞。

注：*P<0.05，**P<0.01；A為RAW264.7細胞；B為骨髓來源巨噬細胞。

3 討 論

β-catenin是進化高度保守的Wnt/β-catenin通路中的核心分子，不僅在生理狀態下發揮重要作用[3-4]，還可在病理條件下如多種病原體感染中發揮調控作用，且因病原體不同發揮的作用不盡相同[5-8]。本研究發現，在銅綠假單胞菌感染時，β-catenin促進銅綠假單胞菌的清除。

β-catenin促進銅綠假單胞菌清除的機制如何，還有待于進一步研究。研究報道，在不同病原體感染中β-catenin促進病原體清除的機制不盡相同。據報道，在傷寒沙門菌感染時，β-catenin可通過上調小腸上皮細胞的核心巖藻糖基化而上調腸道菌群來對抗細菌感染[7]；在HIV感染時，β-catenin可在膠質細胞中抑制HIV長末端重復序列的轉錄，抑制病毒的感染[5]；在DNA病毒感染時，β-catenin可協調環磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶(cGAS)/干擾素基因刺激因子(STING)介導的干擾素信號通路，抑制感染[6]；在豬生殖和呼吸系統綜合征病毒感染時，β-catenin可通過增強核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(NF-κB)介導的自身免疫應答抑制病毒的復制[14]。本實驗結果發現β-catenin可上調抗菌肽LL-37的表達。

LL-37是具有廣譜殺菌作用的抗菌肽。研究報道，LL-37可抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，可促進中性粒細胞釋放活性氧自由基，促進中性粒細胞體外誘捕網的形成，從而達到促進銅綠假單胞菌清除的作用[10-11]。本實驗結果發現，在銅綠假單胞菌感染的巨噬細胞中，β-catenin通過調控LL-37促進銅綠假單胞菌的清除，然而本研究未涉及LL-37促進細菌清除的機制。

綜上所述，本研究發現β-catenin在巨噬細胞中通過調控LL-37促進銅綠假單胞菌的清除，揭示了β-catenin促進銅綠假單胞菌清除的機制，為銅綠假單胞菌感染的治療提供備選方案。