胰激肽原酶對精子質量影響的初步研究*

段 禮，陳 勇，盧奮堅，肖新民，王 勝，田二坡，鐘 影，溫子娜△

1.四川省成都西囡婦科醫院男科中心，四川成都 610011;2.四川省成都市錦江區婦幼保健院生殖醫學中心男科中心，四川成都 610011

近年，輔助生殖技術治療不育不孕癥有了長足的進步，其中精子質量是關鍵因素之一。關于如何保護和提高精子的活力和功能以及如何克服冷凍對精子的不良影響的研究引人關注。目前胰激肽原酶(PK)被廣泛應用于男科疾病的治療，有研究報道其對精液液化及精子質量具有改善作用[1-3]。本研究初步探討PK對精子質量的影響，為改進精子體外保存條件提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年6-9月來成都西囡婦科醫院行輔助生殖治療體檢的男性患者20例，年齡25～35歲。入選標準：精液常規檢查各項參數正常，無傳染病及遺傳病史，近期無吸毒、吸煙、酗酒等不良生活習慣，近期無生殖道感染病史。專科查體：排除精索靜脈曲張，排除前列腺腫大。本研究通過成都西囡婦科醫院倫理委員會及生殖樣本庫批準，所有提供精液標本的患者均知情同意。

1.2方法

1.2.1精液檢查 患者禁欲2～7 d，手淫取精置清潔的一次性取精杯內，放入37 ℃恒溫箱內孵育。精液液化后，將同一份精液均等地分成3份，編為A、B、C組，嚴格按照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)[4]的技術規范進行操作。采用重力分析法測量精液體積，采用HAMILTON THORNE IVOS Ⅱ全自動精液分析儀檢測精子活力。精液參數正常值參考《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)標準。采用BD FACSCalibur流式細胞儀檢測精子染色質(DNA)的完整性，精子核完整性染色試劑盒采用浙江星博生物科技股份有限公司產品。

1.2.2精子冷凍及復蘇 將冷凍保護劑SAGE Quinn′s AdvantageTMSperm Freezing Medium提前置于室溫中復溫并混勻。A、B、C組均按1份體積冷凍保護劑加入1份體積精液的比例添加保護劑，B、C組中分別再加入40、80 U注射用PK(常州千紅生化制藥股份有限公司)，逐滴加入并旋轉凍存管，將混合液在30～35 ℃孵育5 min，檢測3組標本冷凍前的精子常規參數及DNA碎片指數(DFI)。將上述混合液吸入冷凍保存管，再逐步移入液氮中。所有標本冷凍30 d后放入37 ℃的HH-S2恒溫水浴鍋中復蘇，然后利用精液分析儀及流式細胞儀分別檢測復蘇后的精子常規參數及DFI。

2 結 果

冷凍前A、B、C 3組的前向運動精子百分比呈遞增趨勢，B、C組與A組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，復蘇后3組的前向運動精子百分比呈逐漸上升趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。冷凍前A、B、C 3組的精子活動率呈遞增趨勢，B、C組與A組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；復蘇后B、C組的精子活動率高于A組，但差異無統計學意義(P>0.05)。冷凍前A、B、C 3組的精子DFI呈逐漸下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，復蘇后A組的DFI高于B、C組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 冷凍前后各組標本的精子參數比較

3 討 論

目前，隨著輔助生殖技術的發展，人類配子、睪丸組織、卵巢組織等冷凍技術也不斷提高。精子冷凍技術為供精助孕、男性不育癥治療提供了條件，但其本身也會對精子質量及功能造成不良影響[5-6]。隨著冷凍過程中溫度的急劇變化，精子細胞內外的冰晶形成，水分子跨膜移動和滲透壓變化，很容易引起精子細胞膜和線粒體的變化，導致細胞死亡或細胞核的損傷[7]，體現在復蘇后的精子質膜破裂、DNA損傷等方面，最終導致復蘇后精子活力下降，存活率降低，受精能力變差。部分研究表明隨著冷凍時間的延長，這種影響會不斷加大[8]。

影響人類精子冷凍后質量的主要因素有冷凍方法、冷凍保護劑的成分及凍存時間等。近年來，精子的體外冷凍保存技術層出不窮，各種新型冷凍保護劑的問世、冷凍技術的改進，使成功冷凍精子變得更加容易，而怎樣減少冷凍對精子的損傷、盡可能保護精子的功能，是目前精子冷凍技術研究的新方向。鄭九嘉等[9]研究顯示，在精子冷凍保護劑中添加適當濃度的維生素E可以緩解凍融過程對精子造成的傷害，在一定程度上提高凍融后精子的活動力、存活率及精子DNA完整性。本研究在精子冷凍保護劑中添加PK，結果顯示冷凍精子復蘇后的前向運動精子百分比、精子活動率均有增高趨勢，而DFI呈下降趨勢，表明PK可能具有一定的保護精子作用。

生殖系統微循環障礙影響精子質量，而改善微循環已經被作為男性不育的基礎性治療方法寫入中華醫學會男科學分會制訂的《中國男科疾病診斷與治療指南(2016版)》[10-11]。PK又稱胰激肽釋放酶、血管舒緩素，屬蛋白水解酶類，有擴張血管、改善微循環、調整血壓等作用[1,11-12]。從20世紀80年代開始，PK就被應用于男性不育的治療，盡管臨床觀察結果存在一定的爭議，但一些研究結果表明，PK治療可以改善精子質量[1]。文獻[13]報道，體外實驗中將PK加入到精液中，可以增強精子的活動力和穿透宮頸黏液的能力，以及提高精子運動速度，而且對冷凍復蘇后的精子存活率和運動能力都有積極的作用，這與本研究得出的結果一致。50%以上的患者在接受3個月的PK治療后，其精子活力得到改善，同時其正常形態精子的百分率也相應提高，因此在人工授精前常可采用PK對精液進行預處理[13]，該結論在本研究中也得到證實，本研究向新鮮精液加入PK恒溫孵育5 min后，前向運動精子百分比和精子活動率都有明顯提高。

隨著輔助生殖技術的發展，獲得優良精子是提高成功率的關鍵，精子的冷凍保存更是治療男性不育癥中必備的技術，特別是微量精子的冷凍成功，為嚴重少精子、睪丸顯微取精獲得精子提供了生育親生后代的可能。本研究證實了PK有助于提高精子體外保存時的活力，不足之處在于，由于要進行冷凍保存，恒溫孵育時間僅為5 min，接下來筆者團隊將延長孵育時間來進一步驗證這一結論。另外，在常規冷凍保護劑中添加PK，冷凍復蘇后的精子質量有一定改善，但差異不顯著，這一結論有待擴大樣本量來進一步驗證。