免疫熒光法在陰道分泌物病原體檢測(cè)中的應(yīng)用*

尹小毛，賴少芬，馮潔儀，黃錫誼，溫雙花，吳秀春，王麗斯，王治偉△

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528315；2.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東廣州 530001

陰道炎是臨床婦科發(fā)生率較高的一種疾病，其發(fā)病原因有多種，較為常見(jiàn)的是陰道加德納菌、念珠菌和陰道毛滴蟲(chóng)等生殖道病原體導(dǎo)致的感染[1]。目前陰道分泌物細(xì)菌和真菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是培養(yǎng)法，但是該方法操作較為煩瑣，所需時(shí)間也較長(zhǎng)，因此臨床實(shí)驗(yàn)室使用最廣泛的檢測(cè)方法是涂片鏡檢[2]。陰道分泌物常規(guī)檢測(cè)采用直接濕片法或革蘭染色法，能夠較為便捷地檢出陰道加德納菌、念珠菌、陰道毛滴蟲(chóng)等病原體，但是此類方法檢查陰道分泌物存在一定程度的漏檢[3]。免疫熒光法染色通過(guò)熒光素標(biāo)記抗體直接與病原體結(jié)合后顯色，具備免疫學(xué)和形態(tài)學(xué)的雙重優(yōu)點(diǎn)[4]，本研究擬將其與濕片法進(jìn)行分析比較，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 標(biāo)本取自2020年12月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院門診或住院成年女性患者39例。用無(wú)菌窺陰器擴(kuò)張陰道，將無(wú)菌棉拭子于陰道內(nèi)約4 cm處內(nèi)側(cè)壁或陰道后穹窿處采集分泌物，持續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)秒后放入收集管中，旋緊管蓋后立即送檢。

1.2儀器與試劑 熒光顯微鏡購(gòu)自尼康儀器(上海)有限公司，免疫熒光染色試劑購(gòu)自深圳市邁科龍生物技術(shù)有限公司。載玻片和蓋玻片購(gòu)自江蘇飛舟玻塑有限公司，無(wú)菌棉拭子購(gòu)自康正衛(wèi)生材料有限公司。

1.3方法 參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第4版)》進(jìn)行陰道分泌物濕片法常規(guī)檢測(cè)操作。免疫熒光法染色操作步驟：將采集的陰道分泌物涂抹于載玻片中央并干燥固定，加入免疫熒光試劑染色(針對(duì)不同的病原體使用對(duì)應(yīng)的染色試劑)，以試劑剛好覆蓋整個(gè)涂片部位為宜，37 ℃孵育20～30 min，使用蒸餾水緩慢沖洗載玻片數(shù)次，每次5～10 s，再將玻片自然晾干。干燥后使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，先用高倍鏡(×40)搜索疑似視野，然后用油鏡(×100)觀察具體形態(tài)。顯微鏡下：線索細(xì)胞邊緣模糊不清，細(xì)胞內(nèi)外可見(jiàn)大量綠色短桿狀細(xì)菌；念珠菌孢子呈綠色圓形或橢圓形；陰道毛滴蟲(chóng)呈綠色圓形或扁圓形(大于念珠菌)。操作過(guò)程中應(yīng)注意控制免疫熒光試劑的用量、孵育時(shí)間和洗滌時(shí)間，避免因試劑用量過(guò)多、孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和洗滌時(shí)間不夠而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。線索細(xì)胞是診斷加德納菌性陰道炎的重要指標(biāo)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1線索細(xì)胞的檢出情況 共檢測(cè)了39例陰道分泌物標(biāo)本，濕片法和免疫熒光法檢出線索細(xì)胞的例數(shù)分別為15例和9例，陽(yáng)性率分別為38.46%和23.08%，兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 濕片法和免疫熒光法檢測(cè)線索細(xì)胞的結(jié)果比較(n)

2.2念珠菌的檢出情況 濕片法和免疫熒光法檢出念珠菌的例數(shù)分別為15例和14例，陽(yáng)性率分別為38.46%和35.90%，兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 濕片法和免疫熒光法檢測(cè)念珠菌的結(jié)果比較(n)

2.3陰道毛滴蟲(chóng)的檢出情況 濕片法和免疫熒光法均未檢出陰道毛滴蟲(chóng)。

3 討 論

由于生活節(jié)奏的加快和生活習(xí)慣的改變，臨床婦科疾病的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，尤其是陰道加德納菌、念珠菌和陰道毛滴蟲(chóng)等病原體引起的陰道炎[5]。陰道加德納菌可通過(guò)性接觸傳播，在細(xì)菌性陰道炎中非常常見(jiàn)。目前臨床檢測(cè)陰道加德納菌的方法較多，但是受多種因素影響，其檢測(cè)準(zhǔn)確性依然不夠理想[6]。念珠菌在一定條件下可導(dǎo)致陰道炎，其檢出目前主要依靠涂片鏡檢，臨床檢驗(yàn)過(guò)程中還是存在一定程度的漏檢。陰道毛滴蟲(chóng)體積較大，鏡下形態(tài)也比較獨(dú)特，因此相對(duì)比較容易被檢出。

直接免疫熒光技術(shù)主要原理是用熒光素標(biāo)記抗原或抗體，然后與標(biāo)本中的抗體或抗原特異結(jié)合，最后通過(guò)熒光顯微鏡觀察來(lái)實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的檢測(cè)[4]。鑒于濕片法在病原體尤其陰道加德納菌檢測(cè)方面存在的不足，本研究擬分析免疫熒光法染色在陰道分泌物病原體檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

本研究對(duì)39例陰道分泌物標(biāo)本分別采用濕片法和免疫熒光法進(jìn)行病原體檢測(cè)，結(jié)果顯示免疫熒光法檢測(cè)線索細(xì)胞和念珠菌的陽(yáng)性率低于濕片法，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩種方法檢測(cè)陰道毛滴蟲(chóng)的結(jié)果完全一致。濕片法觀察線索細(xì)胞存在較大的主觀影響因素，尤其是細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌形態(tài)的判斷比較難以把握，而且女性陰道菌群較為復(fù)雜，也存在與陰道加德納菌形態(tài)相似的其他細(xì)菌。免疫熒光法采用特異性抗體檢測(cè)陰道加德納菌，因此具有很好的特異性，能夠排除一些形態(tài)相似細(xì)菌的干擾，故本研究中免疫熒光法檢測(cè)線索細(xì)胞的陽(yáng)性率低于濕片法(23.08%vs.38.46%)。已有的一些研究報(bào)道免疫熒光法檢測(cè)線索細(xì)胞具有很好的特異度和靈敏度，其臨床性能優(yōu)于革蘭染色涂片法和唾液酸苷酶活性測(cè)定法[6-7]。本研究免疫熒光法檢測(cè)線索細(xì)胞的陽(yáng)性率較濕片法低，是否反映本研究所用的免疫熒光法靈敏度不高，這需要采用分離培養(yǎng)法來(lái)進(jìn)一步證實(shí)[8]。在檢測(cè)念珠菌方面，因?yàn)槊庖邿晒夥ú捎冕槍?duì)白色念珠菌的特異性抗體，所以不能檢出白色念珠菌以外的其他念珠菌，因此本研究結(jié)果顯示免疫熒光法的陽(yáng)性率略低于濕片法(35.90%vs.38.46%)。由于能直接識(shí)別白色念珠菌，免疫熒光法在一定情況下可以代替分離培養(yǎng)方法。由于本研究中兩種方法均未檢出陰道毛滴蟲(chóng)，免疫熒光法在陰道分泌物滴蟲(chóng)檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值需進(jìn)一步研究。

綜上所述，免疫熒光染色檢測(cè)陰道分泌物病原體具有較好的應(yīng)用價(jià)值，能夠降低線索細(xì)胞的錯(cuò)判率，還可以直接檢出白色念珠菌。臨床實(shí)驗(yàn)室可直接應(yīng)用免疫熒光法染色來(lái)檢測(cè)陰道加德納菌，而對(duì)于念珠菌檢測(cè)而言，免疫熒光法染色不適合作為首選方法，可作為濕片法和分離培養(yǎng)方法的有益補(bǔ)充，也可用于白色念珠菌的直接鑒定。