瀘縣204例珠蛋白生成障礙性貧血患者基因型及血液學(xué)指標(biāo)分析

胡高鏡， 溫先勇

1.四川省瀘州市瀘縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州 646100；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州 646100

珠蛋白生成障礙性貧血屬于單基因遺傳性貧血疾病，以珠蛋白合成障礙為特點(diǎn)，常見類型為α-珠蛋白生成障礙性貧血和β-珠蛋白生成障礙性貧血。珠蛋白生成障礙性貧血目前還缺乏有效的治療手段，攜帶者檢查和婚前、產(chǎn)前診斷是減少受累患兒出生、保障優(yōu)生優(yōu)育的關(guān)鍵手段。確診珠蛋白生成障礙性貧血的可靠依據(jù)是基因診斷，但其技術(shù)性強(qiáng)、耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高，因此推廣受到一定程度的限制，而經(jīng)濟(jì)、便捷、高效的血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)是基層醫(yī)院初步篩查珠蛋白生成障礙性貧血的主要方法之一，在臨床工作中得到廣泛應(yīng)用。本文就瀘縣地區(qū)204例珠蛋白生成障礙性貧血患者基因型及血液學(xué)指標(biāo)進(jìn)行研究，分析該地區(qū)α、β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類型及血液學(xué)特征，為珠蛋白生成障礙性貧血診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 2017年12月至2021年1月瀘縣人民醫(yī)院共向四川金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心送檢來(lái)自瀘縣本地珠蛋白生成障礙性貧血疑似標(biāo)本817例，選擇經(jīng)臨床證實(shí)的珠蛋白生成障礙性貧血患者204例作為珠蛋白生成障礙性貧血組，其中男81例、女123例，年齡0～78歲、平均(20.61±4.26)歲，均符合2007年《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中的珠蛋白生成障礙性貧血診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。選取同期臨床確診的缺鐵性貧血患者30例作為缺鐵性貧血組，其中男12例、女18例，年齡0～68歲、平均(25.33±3.94)歲，均符合2007年《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中的缺鐵性貧血診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。選取同期健康體檢者30例作為健康對(duì)照組，其中男12例、女18例，年齡0～70歲，平均(25.83±4.17)歲，排除貧血癥狀、血液疾病、出血性疾病及肝腎疾病。3組研究對(duì)象性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè) 采用熒光PCR熔解曲線法對(duì)患者α、β-珠蛋白生成障礙性貧血基因進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)3種常見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因：--SEA、-α3.7、-α4.2；3種非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因：369C>G，377T>C，427T>C；17種β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類型：CD17(A→T)、CD41-42(-TCTT)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、-28(A→G)、-29(A→G)、-30(T→C)、-32(C→A)、CD31(-C)、CD43(G→T)、CD71-72(+A)、CD14-15(+G)、CD27-28(+C)、IVS-Ⅰ-1(G→T)、IVS-Ⅰ-5(G→C)、IntM、βEM、CapM(-AAAC)。

1.2.1.1DNA提取及加樣 抽取珠蛋白生成障礙性貧血患者靜脈血約2 mL于EDTA抗凝管中，采用磁珠法在賽默飛715型儀(美國(guó))上提取DNA，試劑由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供。提取的DNA樣本的吸光度比值(A260/A280)在1.6～2.0視為合格。向PCR反應(yīng)管(內(nèi)含20 μL反應(yīng)液)中加入模板DNA 5 μL，反應(yīng)總體系為25 μL。

1.2.1.2基因擴(kuò)增及結(jié)果判斷 按照基因檢測(cè)試劑盒說明書設(shè)定PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析程序，在東勝龍ETC811熒光定量擴(kuò)增儀(國(guó)產(chǎn))進(jìn)行操作，再進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.2血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 3個(gè)觀察組對(duì)象分別于清晨采集2 mL EDTA-K2抗凝靜脈血，2 h之內(nèi)由熟練技師按SOP文件，在Sysmex XS-500i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀上完成檢測(cè)(儀器、試劑均由日本希森美康公司提供)，儀器自動(dòng)測(cè)定、計(jì)算出紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(Hb)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血細(xì)胞比容(Hct)6項(xiàng)血液學(xué)參數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1珠蛋白生成障礙性貧血患者基因分型檢測(cè)結(jié)果 204例確診患者檢出珠蛋白生成障礙性貧血基因202例，檢出率為99.02%。63例α-珠蛋白生成障礙性貧血(31.19%)中檢出基因型9種，見表1。構(gòu)成比最高的前3種基因型為--SEA/αα(雜合缺失)、--SEA/-α3.7(復(fù)合雜合缺失)、αα/-α3.7(雜合缺失)，分別占39.68%、19.05%、19.05%。137例β-珠蛋白生成障礙性貧血(67.82%)檢出基因型16種，見表2。構(gòu)成比最高的前3種基因型為CD17(A→T)雜合突變(37.96%)、IVS-Ⅱ-654(C→T)雜合突變(26.28%)、CD41-42(-TCTT)雜合突變(18.98%)。另外，檢出2例α-珠蛋白生成障礙性貧血合并β-珠蛋白生成障礙性貧血：αα/-α4.2(雜合缺失)合并CD17(A→T)/CD26(G→A)雙重雜合突變、--SEA/αα(雜合缺失)合并CD41-42(-TCTT)雜合突變。

表1 63例α-珠蛋白生成障礙性貧血基因型檢測(cè)情況

表2 137例β-珠蛋白生成障礙性貧血基因型檢測(cè)情況

續(xù)表2 137例β-珠蛋白生成障礙性貧血基因型檢測(cè)情況

2.2各組血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析 與健康對(duì)照組比較，珠蛋白生成障礙性貧血組Hb、MCV、MCH、MCHC、Hct均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；珠蛋白生成障礙性貧血組的Hb、MCV、MCH、Hct與缺鐵性貧血組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MCHC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；RBC在3組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

在我國(guó)，長(zhǎng)江以南的云南、貴州、四川等地區(qū)是珠蛋白生成障礙性貧血高發(fā)區(qū)，而瀘縣地處川滇黔渝結(jié)合部，人口數(shù)量和遷移率大，遺傳背景復(fù)雜，使得珠蛋白生成障礙性貧血成為瀘縣重大社會(huì)公共健康問題之一。了解珠蛋白生成障礙性貧血患者基因型分布特點(diǎn)、血液學(xué)特征對(duì)珠蛋白生成障礙性貧血診斷具有參考價(jià)值，有助于針對(duì)性監(jiān)測(cè)珠蛋白生成障礙性貧血患者的生長(zhǎng)、發(fā)育，以提供相應(yīng)的治療、預(yù)后指導(dǎo)及建議合理的婚配，可防止將其異常基因遺傳給下一代[2]。

α-珠蛋白生成障礙性貧血主要是基因缺失所致，少部分是點(diǎn)突變。本文204例珠蛋白生成障礙性貧血患者中，檢出9種α-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類型，前5位分別是--SEA/αα(39.68%)、--SEA/-α3.7(19.05%)、αα/-α3.7(19.05%)、427T>C(4.76%)、--SEA/-α4.2(4.76%),最常見的突變類型是--SEA，這與中山市[3]、武漢市[4]等地的報(bào)道一致。另外，與瀘州地區(qū)其他相關(guān)報(bào)道[5-6]相比，點(diǎn)突變427T>C所占比例偏高，樣本量較小可能是造成此現(xiàn)象的主要原因。目前已發(fā)現(xiàn)β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類型多達(dá)360種以上，且分布具有種族特異性和區(qū)域特異性。在云南、貴州及四川3省中，CD17(A→T)基因突變占首位；在香港、臺(tái)灣，IVS-Ⅱ-654(C→T)基因突變構(gòu)成比最高；在廣東順德地區(qū)、廣西柳州市，CD41-42(-TCTT)基因突變?yōu)樽畛Ｒ婎愋停辉趶V東、海南、四川等地，IVS-Ⅱ-654(C→T)基因突變構(gòu)成比位居CD41-42(-TCTT)突變之后[7]。本試驗(yàn)檢出β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類型16種，其中CD17(A→T)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、CD41-42(-TCTT)雜合突變構(gòu)成比占前3位，分別為37.96%、26.28%、18.98%。這與上述四川地區(qū)報(bào)道大體一致，與廣東、海南等地區(qū)報(bào)道有差異。

此外，本文204例珠蛋白生成障礙性貧血患者中，尚有2例珠蛋白生成障礙性貧血突變基因未在本試驗(yàn)檢測(cè)范圍內(nèi)，提示珠蛋白生成障礙性貧血基因變異多樣，極具遺傳異質(zhì)性，基因檢測(cè)雖是珠蛋白生成障礙性貧血診斷金標(biāo)準(zhǔn)[8]，但對(duì)某些罕見突變存在一定漏檢風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)RBC、Hb、MCV、MCH、RDW等血液學(xué)指標(biāo)及血紅蛋白電泳、紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)等單項(xiàng)或多項(xiàng)聯(lián)合篩查珠蛋白生成障礙性貧血，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了諸多研究，結(jié)果不盡相同。有研究表明，血液學(xué)指標(biāo)在珠蛋白生成障礙性貧血診斷與鑒別診斷中具有突出的應(yīng)用價(jià)值[9]。本研究結(jié)果顯示，珠蛋白生成障礙性貧血患者Hb、MCV、MCH、MCHC、Hct水平明顯降低，與健康人群差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可為珠蛋白生成障礙性貧血診斷提供依據(jù)。從病理角度分析，珠蛋白生成障礙性貧血患者Hb、Hct水平降低符合貧血的血液學(xué)特點(diǎn)，而且珠蛋白生成障礙性貧血屬于小細(xì)胞低色素性貧血，因此在血液學(xué)指標(biāo)上表現(xiàn)為MCV、MCH、MCHC水平降低。有研究報(bào)道，珠蛋白生成障礙性貧血患者血液學(xué)指標(biāo)中以MCV水平降低為主要特征,MCV是快速篩查珠蛋白生成障礙性貧血的一項(xiàng)重要指標(biāo)[10]。珠蛋白生成障礙性貧血患者RBC水平與健康人群差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，原因可能是由于骨髓代償作用，中輕度珠蛋白生成障礙性貧血患者RBC水平并不會(huì)出現(xiàn)顯著變化[11]。臨床診斷中，珠蛋白生成障礙性貧血易和其他小細(xì)胞低色素性貧血相混淆，例如缺鐵性貧血，二者的致病機(jī)制、治療措施各不相同，比如，某些珠蛋白生成障礙性貧血患者因溶血、反復(fù)輸血、骨髓無(wú)效造血導(dǎo)致鐵過載，常需采取去鐵治療，與缺鐵性貧血患者以補(bǔ)充鐵劑作為主要治療手段完全相反。因此珠蛋白生成障礙性貧血的鑒別診斷在貧血疾病的醫(yī)療工作中尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)，與缺鐵性貧血患者相比，珠蛋白生成障礙性貧血患者Hb、MCV、MCH、Hct水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這與其他相關(guān)研究結(jié)果[12]相同。這些指標(biāo)可作為珠蛋白生成障礙性貧血鑒別診斷的可靠篩查指標(biāo)，為臨床珠蛋白生成障礙性貧血的篩查提供依據(jù)。