核酸轉錄介導的擴增中室內質控方法的探討

季茂勝，趙 欣，張藍江，王 歡，陳 雪，董玉芳，魏彩冰

四川省成都市血液中心血液篩查實驗室，四川成都 610041

目前血液核酸檢測技術(NAT)已在我國采供血機構全面開展和普及，檢測原理主要分為聚合酶鏈反應(PCR)和轉錄介導的擴增(TMA)，使得其在檢測靈敏度和特異度方面表現極佳。通過利用NAT檢測人類免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)，降低了只依賴酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測獻血員標本導致的輸血傳播性疾病的發生[1]。《血站核酸檢測實驗室質量保證指南》中提到血站核酸檢測室內質控的基本要求為每一批次檢測應至少有一個弱陽性室內質控品。各血站實驗室尚未建立較統一的NAT質量控制體系[2-3]，然而室內質控是檢測和評價本實驗室質量管理體系運行情況，確定檢測結果是否可靠、穩定的重要因素[4]。為此本中心實驗室結合實際工作中的室內質控檢測結果，通過繪制箱體圖法和Levey-Jennings質控圖法回顧性分析實驗過程中的檢測情況，對兩種質控分析方法在轉錄介導的擴增中對室內質控的監測情況作比較。

1 材料與方法

1.1室內質控品數據來源 收集2019年3月9日至7月19日本核酸實驗室室內質控品(HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA)檢測的待測物信號/臨界值(S/CO值)。

1.2室內質控品 室內質控品HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA為購于北京康徹思坦公司的標準品，水平分別為30 IU/mL、30 IU/mL、200 IU/mL，批號為20190110，有效期至2021年1月9日。

1.3儀器與試劑 HBV、HCV、HIV1型(Procleix Ultrio Plus Assay)核酸聯檢檢測試劑盒(主批號為700354，有效期至2020年5月15日)及Procleix Tigris核酸檢測系統均購于蓋立復生物診斷公司，試劑使用前在試劑孵育器內32 ℃孵育1 h。嚴格按照儀器和試劑說明書及本實驗室的標準操作文件進行操作。

1.4室內質控品檢測 從-30 ℃冰箱取出室內質控品室溫解凍后，上下緩慢顛倒使其充分混勻(HIV室內質控品為干粉狀態，使用其相應的溶解液充分溶解后顛倒混勻)瞬間離心。在溫度15～25 ℃、濕度20%～85%環境下，室內質控品與常規標本一同檢測。機器在使用的情況下，每天做一次HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 3個項目的室內質控品檢測。結果判讀：僅當核酸檢測試劑盒自帶的校準物與對照品同時有效時，室內質控品才能判斷為有效，記錄S/CO值。

1.5箱體圖的繪制 使用統計軟件SPSS17.0分別計算HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA室內質控品的中位數(M)、下四分位數(QL)、上四分位數(QU)、四分位數間距(QR)=QU-QL，繪制箱體圖判定離群值；也可以通過計算離群值上下限判定離群值，即當S/CO值>QU+1.5QR或

2 結 果

2.1箱體圖結果 實驗期間在一臺Procleix Tigris機器上共檢測了86組HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA室內質控品數據。3個項目的M、QL、QU、QR及離群值上、下限如表1所示。當HBV-DNA室內質控品檢測的S/CO值<12.86或>15.36時判斷為離群值；HCV-RNA室內質控品檢測的S/CO值<8.44或>11.13時判斷為離群值；HIV-RNA室內質控品檢測的S/CO值<9.84或>14.51時判斷為離群值。在檢測的86組數據中HBV-DNA的第32次(S/CO值為16.03)、38次(S/CO值為16.04)為離群值；HCV-RNA室內質控品無離群值；HIV-RNA室內質控品的第32次(S/CO值為14.59)為離群值，與通過SPSS17.0統計軟件繪制的箱體圖所顯示的離群值結果一致，見圖1。

表1 室內質控品百分位數及離群值上、下限

圖1 室內質控品S/CO值箱體圖

圖2 HBV-DNA室內質控品Levey-Jennings質控圖

圖4 HIV-RNA室內質控品Levey-Jennings質控圖

3 討 論

箱體圖是利用數據中的5個統計量即最小值、QL、M、QU與最大值來描述數據的一種方法(箱體圖的最下、上線段為最小、大值；中間箱體的下、上沿為QL和QU)，它可以看出數據是否具有對稱性、分布的離散程度等信息[5]，離群值以星號或圓點在箱體圖的上方或下方顯示，箱體圖的繪制依靠實際數據，不需要事先假定數據服從特定的分布形式，不對數據作任何限制[6]。圖1中可以看出HIV-RNA的箱體上下高度范圍(即QR)比HBV-DNA、HCV-RNA箱體高度范圍大，表明HIV-RNA的離散程度大于HBV-DNA、HCV-RNA的離散程度，這與它們之間s、CV的差別一致[7]。

目前國內采供血機構核酸實驗室普遍的做法是采用定性的方法進行質量控制[12]，即外部質控品HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA檢測結果為反應性的情況下，本批次實驗結果有效。雖然結果中HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA室內質控品分別4次、4次、6次超出失控限，但S/CO值定性結果為反應性，實際工作中筆者依然判斷當批次檢測有效，當室內質控品S/CO值超出失控限時，如果內標、對照有效依然可以判斷實驗有效。這是因為在每一次實驗運行過程中，Procleix Ultrio Plus Assay的內部質控體系通過以下3個方面達到自身實驗監控的目的：(1)內標。通過包含內標的目標捕獲試劑將內標添加到每個檢測標本、對照或校準物管中，使試劑的內標在標本處理、擴增和檢測步驟中均可作為質控品來監測實驗過程，每個測試管的有效性需要內標的相對光值大于或等于內標臨界值[13]。(2)對照。陰性對照呈無反應性并且陽性對照呈反應性時本批次實驗有效。(3)校準物質。雖然它的檢測是為了計算待測物和內標的臨界值，但它的有效或無效也能在一定程度上起到監測實驗的作用。內部質控體系可以全面覆蓋檢測的整個過程，但是僅可以作為當批次實驗有效性的驗證，并不能監測儀器整個使用周期中NAT體系(包括儀器、試劑、質控品)的穩定性情況[14]，而Levey-Jennings質控圖法通過室內質控品的監控可以很好地彌補這方面的不足。 圖2中86次HBV-DNA室內質控品S/CO值圍繞平均值隨機上下波動，其中第32、38、50、62次超出失控限，分析原因發現第32、38、62次實驗當天機器出現“磁清洗工作臺液位感測故障”，采取的措施是實驗開始前增加一次磁力工作站的高級磁力沖洗以減少其故障的發生，但第50次機器運行情況正常，猜測是由機器的偶發故障所造成；圖3中HCV-RNA室內質控品S/CO值從第65次起出現在平均值一側，觀察發現所用蓋立復試劑并未更換批號，排除試劑原因。所用機器在六月中旬曾做過半年維護保養(正好為第65次的時間段)，由于測量化學發光信號的冷光儀經過校正，導致室內質控品數值不同于校正前的數值，機器的系統誤差造成結果漂移，解決辦法是在維護保養后應重新繪制質控圖，以排除儀器校正對質控結果的影響；而圖4中HIV-RNA室內質控品從第56次起后面的檢測值都低于平均值，分析原因可能是由于HIV-RNA作為核糖核酸易于降解(質控品為干粉)在保存過程中隨著時間的延長RNA降解導致濃度降低，致使S/CO值低于平均值造成的，使用新訂購的室內質控品并盡快使用以減少保存時間對濃度的影響。

兩種質控方法相比較，箱體圖法僅僅可以發現少數離群值，而通過Levey-Jennings質控圖中超出失控限原因的分析[15]，不僅可以評估儀器的運行狀態，還可以監測試劑和質控品的質量狀態，監測核酸檢測體系的穩定性，從而更好地保證核酸檢測的質量控制。