白皮杉醇抗惡性黑色素瘤的體內外實驗研究

余波 劉偉 胡敏琪 唐休發 李春潔 闕林

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫院頭頸腫瘤外科，成都610041

惡性黑色素瘤是一種起源于黑色素細胞且惡性程度極高的腫瘤，早期即可發生轉移[1]，從全球數據來看，盡管其發病數僅占皮膚惡性腫瘤總數的5%，死亡例數卻占皮膚癌的大部分[2]。其可發生于皮膚、黏膜、內臟等部位，特別是四肢極易摩擦部位[3]。目前，惡性黑色素瘤已經成為世界上發病率增長最快的惡性腫瘤之一，年增長率為3%～5%，我國每年新發病例約為2萬例，惡性黑色素瘤患者死亡與新發病例的比例明顯高于全球平均水平[4]。2020年，美國預計新增皮膚黑色素瘤100 350例，新增死亡6 850例[5]。對于美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期中0期、IA期、IB期的早期惡性黑色素瘤，首選的治療方式依然為手術切除，選擇做有足夠安全范圍的切除，可使患者具有良好的預后[6]。但是對于手術無法切除，或者發生多處轉移而切除效果欠佳的晚期患者，則預后極差[7]，然而隨著免疫治療及靶向治療的發展，比如常用的達拉菲尼聯合曲美替尼針對具有BRAF V600E突變的病例[8]，伊馬替尼針對具有KIT突變的病例[9]，抗細胞毒性T細胞淋巴細胞抗原4（ytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）及抗程序性細胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）抗體均取得了良好的效果[6,10]，其預后得到了一定的改善。有報道[11]稱有遠處轉移的患者其中位生存期為6～12個月，5年生存率為5%，而另有報道[12]發現相應的中位生存期可達24個月。但是24個月的中位生存期并不能讓人完全滿意。另外多種藥物只對相應的類型發揮效果，不能對所有惡性黑色素瘤產生治療效果，如口腔惡性黑色素瘤[13]。再有該類治療伴有不同程度的不良反應[14-15]，所以期望探索更多的治療方式。

白皮杉醇（piceatannol，PIC）是白藜蘆醇的類似物和代謝產物，是一種常見的天然二苯乙烯，廣泛存在于葡萄、甘蔗、百香果、越橘屬漿果、大黃、桂皮和大戟屬植物等多種水果和植物中的化合物[16]，具有多種生物學功能[17]。近年來，PIC在抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞侵襲和遷移能力等方面的作用越來越多地受到關注[18]。根據Du等[19]的研究，PIC可以促進miR-181a的表達，miR-181a通過抑制黑色素瘤細胞中的Bcl-2介導了促凋亡作用，提示PIC可能是治療黑色素瘤的有效藥物。但該研究并未對PIC是否對黑色素瘤其他功能具有作用及可能機制做進一步探討。另一方面，PIC作為脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）的選擇性抑制劑，能有效抑制Syk的磷酸化而發揮各種生物學作用，這可能也是PIC發揮腫瘤抑制功能的機制。故本實驗擬通過體內外研究對PIC是否能抑制惡性黑色素瘤的其他功能以及其可能作用機制進行探究。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

1.1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠（成都達碩生物科技有限公司），實驗經過四川大學華西口腔醫院醫學倫理委員會批準（倫理號：WCHSIRB-D-2017-77），實驗過程對動物的處置符合倫理學要求。

1.1.2 材料、器材和試劑 惡性黑色素瘤細胞系B16F10（由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供）。10%胎牛血清、DMEM/F12培養基、OPTI-MEM培養基（Gibco公司，美國），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（上海碧云天生物技術公司），兔抗鼠Syk抗體、兔抗鼠磷酸化Syk抗體、兔抗鼠磷酸甘油醛脫氫 酶 （glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（Affinity公司，美國），兔抗鼠基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2抗體、兔抗鼠MMP-9抗體、兔抗鼠血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（Santa Cruz公司，美國），羊抗兔二抗（SAB公司，美國），PIC（Selleck公司，美國），預染蛋白質相對分子質量標準液、Lipofectamine 2000轉染試劑（Invitrogen公司，美國），PureLink?RNA小量試劑盒（Life Technologies公司，日本），實時定量聚合酶鏈反應（real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒（TAKARA公司，日本），聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（PALL公司，美國），CFX96實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測系統（Biorad公司，美國）。

1.2 細胞培養及分組

培養惡性黑色素瘤細胞系B16F10細胞時使用含有10%胎牛血清、雙抗的DMEM/F12培養基。細胞培養于37℃，5%CO2恒溫培養箱。細胞每隔2～3 d進行傳代，選擇處于對數生長期、生長狀態佳的細胞用于實驗。為了檢查沉默Syk后B16F10細胞的侵襲及遷移能力，分組為：以siRNA-Syk轉染細胞做siRNA實驗組，NC作為對照組；為檢查PIC對B16F10細胞活力的影響，以PIC溶于DMSO配置為濃度0、20、40、60、80、100μmol·L-1的溶液處理細胞做抑制劑實驗組，以DMSO處理細胞作為對照組；為了檢查PIC處理對B16F10細胞侵襲及遷移功能的影響及MMP-2、MMP-9、VEGF的表達變化，以PIC溶于DMSO配置為濃度10、20、30μmol·L-1的溶液處理細胞做抑制劑實驗組，以DMSO處理細胞作為對照組。

1.3 小干擾RNA轉染細胞

針對Syk基因序列設計siRNA。siRNA-Syk序列為5’-GAACUGGGCUCUGGUAAUU-3’，siRNA-NC為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。轉染前1 d以每孔5×105個B16F10細胞接種于6孔板中，待細胞密度達30%～50%時進行轉染。轉染時配置A液將2×10-11mol siRNA溶于50μL OPTIMEM無血清培養基制成；B液將1μL Lipofectamine 2000溶于50μLOPTI-MEM無血清培養基，混勻室溫靜置5 min制成；將A、B混合為C，靜置20 min；將C加入對應孔中。

1.4 蛋白印跡法測定蛋白表達水平

首先提取細胞蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒進行定量檢測。蛋白樣品中加入5×上樣緩沖液，在100℃煮沸5 min。各上樣孔加40μg蛋白樣品，以10%的分離膠、5%的濃縮膠，在90 V恒壓條件下電泳，染料移動到電泳槽的底部時停止電泳。200 mA置于冰浴中轉膜1.5 h。把膜放在5%牛血清白蛋白中封閉1 h。PVDF膜放在一抗（MMP-2、MMP-9、VEGF、Syk、p-Syk抗體以5%BSA稀釋）中，置于4℃孵育過夜。取出PVDF膜，TBST洗膜，二抗室溫孵育1 h。電化學發光攝取圖像。

1.5 MTT法檢測細胞活力

將各組細胞以每毫升1×105個細胞的密度接種于96孔培養板中，設復孔5個，每孔加入細胞懸液100μL。第2日加入相應刺激。37℃培養24 h。每孔加入20μL MTT溶液，繼續培養4 h后小心吸去培養液，每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，用酶標儀在570 nm處測量各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.6 RT-qPCR

PureLink?RNA小量試劑盒提取細胞mRNA，分光光度法測定RNA濃度后調平濃度，將mRNA逆轉錄為cDNA。使用CFX96實時定量PCR檢測系統檢測mRNA的表達量。引物由日本Life Technologies公司合成。Syk上游引物序列：5’-ACTTGGTCAGCGGGTGGAAT-3’，下游引物序列：5’-GGGTGCAAGTTCTGGCTCAT-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列：5’-GTGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。最后，用2-ΔΔCT統計學方法分析結果。

1.7 劃痕實驗

將各組細胞（每孔5×105個細胞）接種在6孔板上。當細胞密度達到90%時，用200μL槍頭垂直背部橫線劃痕。然后用PBS洗3次，繼續培養，分別于劃痕的0、8 h觀察并拍照測定細胞遷移能力。實驗重復3次。

1.8 Transwell侵襲實驗

檢測各組細胞的侵襲能力。PBS清洗后使用胰酶消化細胞，離心棄去培養液，再使用無血清含1%雙抗的DMEM/F12培養基制備為細胞懸液，將細胞接種于自帶凝膠化Matrigel基質的上室，下室加入全營養DMEM/F12細胞培養液，37℃、5%CO2培養24 h后，抹去上室膜上表面細胞及Matrigel凝膠后，置于4℃冷室，用-20℃保存的甲醇固定10 min，吸棄固定液后，室溫下0.5%結晶紫染色，雙蒸水洗滌，顯微鏡下拍照，計數。

1.9 荷瘤小鼠實驗

PBS清洗后使用胰酶消化B16F10細胞，置于冰上降低細胞代謝。選擇生長狀態良好，體重18～20 g的C57BL/6小鼠，小心剃去背部靠后毛發。將含2×106個細胞的細胞懸液注射入皮下。繼續飼養并在第4、7、10天均分別以濃度為0、10、20、40 mg·kg-1腹腔注射PIC，在第5、8、11、14天測量并計算腫瘤體積，第14天處死小鼠取出瘤體進行測量。

1.10 統計分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準誤表示，各組之間的比較使用方差分析進行，檢驗標準設置為α=0.05。

2 結果

2.1 PIC抑制B16F10的增殖、遷移及侵襲能力

對B16F10細胞使用濃度為0、20、40、60、80、100μmol·L-1的PIC溶液進行處理，經過MTT實驗顯示其細胞活力隨濃度升高而降低，且差異具有統計學意義（P＜0.001）；Western blot結果顯示PIC能夠顯著阻礙Syk的激活，PIC處理后B16-F10細胞的MMP-2、MMP-9、VEGF表達減少，且減少量與濃度呈正相關；劃痕實驗表明，PIC處理后細胞的遷移能力隨PIC濃度升高而逐漸減弱，Transwell實驗證明其侵襲能力也逐漸減弱（圖1）。

圖1 PIC處理使B16F10細胞活力、遷移侵襲能力下降Fig 1 Treating with PICdecreased theviability,migration and invasion of B16F10 cells

2.2 沉默Syk使B16F10細胞增殖、遷移和侵襲能力下降

si-Syk處理B16F10細胞，PCR驗證了所選擇的siRNA能夠有效降低Syk的表達。MTT實驗表明經si-Syk處理后的B16F10細胞增殖受到抑制，Western blot實驗表明si-Syk組細胞中與腫瘤侵襲功能相關的MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表達量較NC組下降，劃痕實驗表明si-Syk組細胞遷移能力較NC組減弱（圖2）。

圖2 小干擾RNA沉默Syk使B16F10細胞活力、遷移侵襲能力下降Fig 2 Silencing Syk by siRNA decreased theviability,migration and invasion of B16F10 cells

2.3 PIC抑制B16F10在小鼠體內成瘤能力

經過B16F10皮下注射構建荷瘤小鼠，在0、10、20、40 mg·kg-1腹腔注射PIC后，其腫瘤進展受到顯著抑制并且存在明顯的劑量依賴作用（圖3）。

圖3 梯度濃度PIC處理小鼠對皮下成瘤的影響Fig 3 Effect of gradient concentration of PICon subcutaneoustumorigenesisin mice

3 討論

惡性黑色素瘤是一種惡性程度極高的腫瘤，近年來，其發病率及死亡率逐漸增加，并呈年輕化趨勢[20]。晚期惡性黑色素瘤的治療有了更多的選擇[21]。但是考慮到各種治療的局限性[22]，應該積極探索新的藥物及其作用機制。

PIC作為一種天然小分子化合物，擁有多種生物活性，已經被證實對多種腫瘤細胞，如前列腺癌細胞、乳腺癌細胞、口腔鱗癌細胞的增殖、遷移、侵襲有一定的抑制作用[19,23]。本研究中，MTT檢測結果發現PIC能抑制B16F10細胞活力；劃痕實驗和Transwell實驗結果發現PIC能夠抑制B16F10細胞遷移、侵襲能力，且強度與PIC濃度呈正相關。PIC處理后細胞中MMP-2、MMP-9、VEGF表達降低，且與PIC濃度呈正相關。MMP-2、MMP-9是一類蛋白水解酶，它們可以降解細胞外基質的多種成分，允許腫瘤擴散，促進腫瘤細胞侵襲[24]；VEGF則是具有促血管生成活性的生長因子，對內皮細胞具有促有絲分裂和抗凋亡作用，可以增加血管通透性，促進細胞遷移[25]。

為了探究PIC作用的可能機制，首先通過Western blot實驗，發現PIC處理的B16F10細胞內Syk蛋白表達水平下降，且磷酸化明顯減少，驗證了PIC對Syk的抑制作用。既往研究[26]認為，Syk主要在免疫信號轉導方面發揮作用，是炎癥反應中的重要分子。但是近年來發現了它的其他生物學功能，比如細胞黏附、免疫識別等。此外，又逐漸發現其在在不同類型的腫瘤中顯示出促癌與抑癌兩方面功能。通過RNA干擾沉默Syk后發現B16F10細胞的活力下降，遷移能力減弱，與細胞侵襲遷移功能相關的功能蛋白MMP-2、MMP-9、VEGF的表達也相應的下降。這說明Syk在惡性黑色素瘤細胞的發展中起到促癌的作用。PIC可抑制Syk而對惡性黑色素瘤細胞發揮抑制作用。

為進一步研究PIC是否能在體內環境抑制惡性黑色素瘤，對小鼠腹腔注射B16F10細胞，從而成功構建了小鼠荷瘤模型，而后以PIC多次給藥模擬給藥過程。結果小鼠成瘤體積與PIC給藥濃度呈負相關，這說明PIC對體內的腫瘤有抑制作用。

綜上所述，本研究通過體內外實驗，發現PIC能夠在體外抑制惡性黑色素瘤細胞的遷移、侵襲等功能，在體內抑制惡性黑色素瘤的生長。PIC可能成為治療皮膚惡性黑色素瘤的一種新選擇。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。