人釉原蛋白全長及其功能片段的體外自組裝和礦化行為的研究

鐘秀 賴婷婷 陳亮 田鯤

1.西南醫科大學口腔醫學院，瀘州646000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院口腔科，成都610072；3.遵義醫學院，遵義563000

釉質覆蓋在牙冠表面，作為人體最堅硬的組織具有強大的機械性能，但一經損傷不能再生。因此，釉質的仿生修復具有重要的科學價值和治療需求。釉質發育的礦化過程由成釉細胞分泌的細胞外基質蛋白持續介導，其中釉原蛋白（amelogenin，AM）及其裂解產物占90%以上[1]。AM主要由含45個氨基酸的N端酪氨酸富集段（tyrosinerich amelogenin peptide，TRAP）、X-Y-脯氨酸重復序列組成的疏水性中央區域、相對較短含11個氨基酸的親水性帶電荷C末端3部分組成[2]，其中親水性C末端以及疏水性N末端高度保守，具有重要的生理學相關性，在釉質發生中發揮作用。

N末端主要影響AM的自組裝并調節蛋白間的相互作用[3]。蛋白水解的N末端裂解形成較小的TRAP功能肽，參與了釉基質蛋白的相互作用過程，為組裝中的各種釉基質蛋白提供分子連接位點[4]。亮氨酸富集段（leucine-rich amelogenin peptide，LRAP）由AM的26個C-末端氨基酸和33個N-末端氨基酸構成，包含了AM完整的帶電C末端。LRAP主要影響對無機晶體的吸附，能穩定無定形磷酸鈣（amorphous calcium phosphate，ACP），調節其晶體平行排列，引導ACP轉化為有序的束狀磷灰石晶體[5]。LRAP還能指導成釉細胞、骨細胞的分化[6]，促進牙周組織的再生[7]等。

AM在釉質礦化過程中具有無法替代的地位，體外“仿生礦化模板”對AM及其功能片段的模仿程度越高，引導生成的羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）晶體排列就越接近天然牙釉質，使得AM及其功能片段在體外誘導釉質再生領域中具有廣闊的應用前景。但目前關于AM功能片段LRAP及TRAP的單獨研究較少，且大多使用動物蛋白，如鼠、豬等。因此本實驗重組表達了人AM及功能片段LRAP和TRAP，觀察比較其自組裝過程，探尋其從單分子克隆到礦化骨架的組合變遷。并在不同時間點添加AM、LRAP及TRAP以模擬體內蛋白作用順序，觀察不同時間段HA晶體的形成特點，旨在探討AM和功能片段LRAP和TRAP在釉質發生及HA晶體各向生長過程中的可能機制，為釉質仿生修復治療提供更多的參考和依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

選取正畸患者預防性拔除的處在釉質發育階段的下頜第三磨牙牙胚（四川省醫學科學院·四川省人民醫院齒槽外科），全部取樣均取得患者及其監護人同意。Trizol RNA分離試劑、質粒提取試劑盒（上海賽默飛世爾科技有限公司），pMD19-T載體（大連寶生物工程有限公司），pET-28a（+）載體、BL21（DE3）Chaprone感受態細胞、大腸桿菌Top10感受態細胞（四川省醫學科學院·四川省人民醫院人類疾病基因研究四川省重點實驗室），大腸桿菌BL21plys（北京全式金生物技術有限公司），pCold-SUMO載體、Ni-NTA純化樹脂（杭州?；锟萍加邢薰荆?-羥乙基哌嗪乙磺酸（N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonicacid，HEPES）緩沖液、MgCl2、CaCl2·H2O、KH2PO4、KCl、NH4Cl、NaF（杭州眾化科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 AM全長的合成 從處于釉質發育階段的兒童下頜第三磨牙的牙胚中提取牙胚細胞總RNA，設計AM全長上游引物序列為5’-CGCGGATCCATGGGGACCTGGATTTT-3’，下游引物序列為5’-CGAGCTCTTAATCCACTTCCTCCCGC-3’。通過逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）反轉錄、擴增得到AM全長的cDNA，與pMD19-T載體進行質粒構建后轉入大腸桿菌Top10中擴增，篩選與鑒定后得到AM全長基因。AM全長基因與原核表達載體pET-28a（+）進行質粒構建，將重組質粒進行篩選和鑒定后用熱激法轉化到大腸桿菌BL21plys中，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導表達，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）檢測，純化，得到AM全長。

1.2.2 LRAP和TRAP片段的合成 用以上AM全長基因做模板，設計LRAP上游引物序列為5’-CGCGGATCCATGCCTCTACCACCTCATCCT-3’，下游引物序列為5’-CGAGCTCTTAATCCACTTCCTCCCGCTTG-3’；TRAP上游引物序列為5’-CGCGGATCCATGCCTCTACCACCTCATCCT-3’，下游引物序列為5’-CGAGCTCTTACCATCCACCCATGGGC-3’。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增構建LRAP、TRAP基因，克隆后測序鑒定。將LRAP、TRAP基因分別和pCold-SUMO原核表達載體進行質粒構建，鑒定后轉化到BL21（DE3）Chaprone宿主菌中，IPTG誘導表達，表達產物進行SDS-PAGE驗證，rTEV酶切后Ni-NTA純化樹脂純化，得到LRAP、TRAP蛋白。

1.2.3 自組裝實驗 在50×三氯基甲烷（Tris-HCl，pH=8）中分別加入純化的AM全長、LRAP、TRAP蛋白儲備液（2 mg·mL-1），調節pH至8，最后再添加適量50×Tris-HCl（pH=8），在冰上建立最終的蛋白質溶液，濃度為100μg·mL-1。用毛細吸管吸取各蛋白溶液滴至銅網多孔碳側，在室溫下孵育1～15 min，分別在1、15 min時夾取銅網，濾紙吸去多余溶液，1%過濾磷酸-鎢酸負染30 s，濾紙吸去染液，室溫干燥后透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察其自組裝過程。

1.2.4 體外礦化實驗 配制人工唾液，在20 mmol·L-1HEPES緩沖液中加入一定量的CaCl2·H2O（1 mmol·L-1）、MgCl2（0.2 mmol·L-1）、KH2PO4（4 mmol·L-1）、KCl（16 mmol·L-1）和NH4Cl（4.5 mmol·L-1），調節pH至8，使用前加入NaF（3×10-4）。在玻片上滴加2 mL人工唾液，滴入AM蛋白儲備液至AM蛋白濃度為100μg·mL-1，孵育3 d后掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察新生晶體形貌；再滴入等量TRAP、LRAP蛋白儲備液至TRAP、LRAP蛋白濃度為100μg·mL-1，繼續孵育3 d，SEM再次觀察新生晶體形貌。

1.2.5 X射線衍射分析 采用DMAX-3A型X射線多晶衍射儀對礦化6 d的新生晶體進行分析，工作條件為：CuKα射線，電壓70 kV，電流50 mA，衍射起始角10°，衍射終止角80°，步長0.02°。

2 結果

2.1 AM全長及LRAP、TRAP的合成和鑒定

PCR擴增構建的AM全長、LRAP、TRAP基因經1%瓊脂糖凝膠電泳后，可分別見570、230、130 bp的特異性條帶，與AM全長、LRAP、TRAP基因理論大小基本相符（圖1）。對獲得的重組蛋白進行SDS-PAGE后，可分別見大小23 000、5 000、6 000的條帶，與AM全長、LRAP及TRAP的理論相對分子質量基本符合，表明成功重組并表達了AM全長、LRAP及TRAP蛋白（圖2）。

圖1 AM全長及LRAP、TRAP基因的重組Fig 1 Recombination of AM,LRAPand TRAPgenes

圖2 AM全長及LRAP、TRAP的SDS-PAGE圖譜Fig 2 SDS-PAGEof AM,LRAPand TRAP

2.2 AM全長的自組裝結果

蛋白液孵育1 min時，溶液中的AM全長大部分以單體形式存在，單體直徑為1～2 nm。繼續孵育15 min時，蛋白單體自組裝形成了直徑20～30 nm的“納米球”。這些納米球進一步聚集，可見3個納米球成角串起形成的“三角形”結構，數個納米球排列形成的“串珠樣”結構以及多個納米球聚集形成的有進一步排列成鏈狀、網狀趨勢的不規則結構，呈現AM全長的分級自組裝（圖3）。

圖3 AM全長自組裝的觀察結果Fig 3 Micrographs of full-length AM self-assembly

2.3 LRAP的自組裝結果

LRAP蛋白溶液在孵育1 min時，溶液中的LRAP蛋白多以單體形式存在，孵育15 min后TEM下仍不能明顯觀察到LRAP蛋白自組裝形成的納米球及中間結構，溶液中的蛋白優勢形態為無結構的單體形態，也可見少量低聚物（圖4）。

圖4 LRAP自組裝的觀察結果 TEM ×500 000Fig 4 Micrographs of LRAP self-assembly TEM ×500 000

2.4 TRAP的自組裝結果

TRAP蛋白溶液在孵育1 min時，溶液中僅見蛋白單體。孵育15 min后，溶液中可見明顯的直徑20～50 nm的納米小球。TRAP蛋白形成的納米球形狀十分規則，呈均勻的圓球形，沒有明顯的內部結構，外周有月暈狀的黑色光圈，且納米小球的直徑越大，其外周的光圈越明顯。TRAP蛋白由單體到納米球的形成中無分級組裝過程，且組裝形成的納米小球之間無進一步聚集的趨勢，相互之間孤立存在（圖5）。

圖5 TRAP自組裝的觀察結果

2.5 體外礦化實驗結果

AM在人工唾液中孵育3 d后，可見其引導的新生晶體呈細長棒狀，沿c軸取向，直徑55～60 nm，平均長度800 nm，數個晶體相互呈一定角度捆綁形成直徑220 nm的晶體束。加入TRAP、LRAP孵育3 d后，新生晶體在a、b面生長欠佳，直徑無明顯變化（60～65 nm），而在c軸上顯著伸長（1 200 nm）；晶體較AM單獨誘導數量更多、取向更佳，形成直徑為500 nm的晶體束，絕大部分細長棒狀晶體有序近似平行排列，僅有晶體束最外層的少量晶體與晶體束長軸成較大角度排列（圖6）。

圖6 不同時間點加入相應蛋白誘導生成的晶體Fig 6 The crystals induced by the corresponding proteins were added at different time

2.6 X射線衍射分析結果

X射線衍射圖譜在2θ衍射角為25.8°、32°、32.2°和32.9°處出現強度不同的衍射峰，分別與HA晶體（002）、（211）、（112）、（300）面的特征峰一致，表明AM及TRAP、LRAP誘導新生的晶體為HA晶體（圖7）。

圖7 新生晶體的X射線衍射圖Fig 7 XRD pattern of thenewborn crystal

3 討論

成熟釉質主要由HA晶體組成，這些晶體平行排列，形成釉柱，而釉柱又定向排列成高度有序的釉質結構。釉質中的HA晶體非常狹長、呈六方棱柱形，在c軸方向延長，表觀長度一般為250～1 000 nm，寬 度 為60～100 nm，厚 度 為26.3～35.0 nm。與天然HA晶體一樣，釉質中的HA晶體由六面晶體的晶胞組成，晶胞六邊形邊長為0.943 2 nm，長度為0.688 nm[8]。

成釉細胞在分泌期合成的有機基質可分為AM和非釉原蛋白兩類，其中AM占90%以上。發育中天然牙的釉質基質里，AM及其酶解產物融合成較大尺寸的納米結構而發揮作用，在釉質成熟后則基本消失。AM分泌到釉基質中很快被裂解，在分泌早期，基質金屬蛋白酶-20（matrix metalloproteinase-20，MMP-20）在有限且相同的位點裂解或加工全長AM，產生富含酪氨酸的TRAP、相對分子質量為23 000的中間肽段和不同的C末端片段；而在成熟期，激肽釋放酶4（kallikrein4，KLK4）會特異性地將MMP-20處理后的釉基質蛋白降解為更小的多肽，被成釉細胞徹底吸收，無機物含量能達到95%，控制著釉質的賦形和礦化率[9]。

在體外，AM在pH=8和37℃環境中，N端疏水的脯氨酸富集區域相互聚攏，C端親水的帶電荷氨基酸尾巴TLAGGVA朝向外，形成直徑20 nm的球狀納米自組裝體，然后納米小球多向延伸，組裝成納米鏈和納米網狀結構[10]，與本實驗結果相符。而本實驗結果表明：TRAP片段形成沒有親水氨基酸尾巴的納米微球，且納米球之間沒有相互進一步聚集成鏈狀、網狀的趨勢；LRAP片段則一直處于無結構的單體形態；AM單獨誘導3 d后形成棒狀HA晶體，再加入TRAP、LRAP蛋白誘導3 d后，HA晶體在c軸方向快速擇優生長，而a、b平面生長被抑制，且晶體取向更優。在磷酸八鈣晶體（octalcium phosphate，OCP）的生長實驗中，AM的疏水部分在控制晶體形狀方面起作用，最有可能是通過在a、b晶體平面上的選擇性吸附來抑制a、b平面的生長，這一抑制過程與C端區域無關，而帶負電荷親水的C端區域能通過Glu和Asp殘基側鏈羧基之間的金屬離子螯合作用調節OCP晶體沿c軸方向相互平行排列[11]，與本實驗結果相符。

結合本實驗的結果及HA晶體的生長過程來看，可能的機制是，在釉質礦化的生長基元形成期，AM分級自組裝形成球形超分子結構，COOH-端親水尾部基團與鈣離子發生交聯反應，啟動礦化過程，納米球開始HA成核然后繼續和釉原蛋白COOH-端的負電基團緊密結合。由于HA晶體表面電荷分布的空間匹配，納米球聚集在其周圍沿著晶體的c軸包裹晶體，組裝成納米長鏈，這種長鏈結構為晶體的成核和c軸方向生長提供有序模板，并阻止a、b晶面融合生長趨勢。隨后在生長基元疊合期，MMP-20選擇性降解AM，形成一些功能小分子蛋白片段，其中疏水性的TRAP及中間肽段組裝成納米微球，包覆a、b軸面，因其負電性及親水性均減弱，屏蔽了HA晶體a、b軸向的晶面結合位點。與此同時，c軸上成核位點暴露，鈣磷鹽不斷沉積，晶體迅速沿著c軸擇優生長，在親水帶負電LRAP的調節下相互平行排列。最后，在KLK4的作用下，大部分蛋白降解后被成釉細胞徹底消化，蛋白與HA晶體的結合降低，對a、b軸面的包覆作用減弱，成核位點暴露，晶體得以沿著a、b軸方向生長、變粗，最終成熟。

許多研究已經實現了AM促進釉質形成的過程，并肯定AM的重要作用，但AM全長及其被降解的功能片段完成一系列引導HA晶體不同時機不同軸向生長的具體機制還未完全清楚。本實驗對比了AM全長、TRAP和LRAP的自組裝行為，并根據以上蛋白多肽在釉質發育過程中的大致作用時間順序設計體外礦化實驗，結果表明：AM全長分級自組裝形成直徑20～30 nm的“納米球”后有進一步多向延伸組裝成鏈狀、網狀趨勢；疏水的TRAP組裝成直徑20～50 nm的孤立納米球，無分級組裝過程；而LRAP自組裝行為不明顯，多以無定形單體形式存在；AM在體外單獨誘導可形成細長的棒狀HA晶體，繼續加入TRAP、LRAP蛋白后HA晶體在c軸明顯延長，而a、b平面生長欠佳，且晶體取向更優。本實驗結果與體內HA晶體定向生長的機制契合，為它們在HA晶體形成過程中的作用提供了理論依據。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。