兩種測定人血漿中維生素E 方法的比較分析

謝寶英

維生素E 具有強大的抗氧化和清除自由基的作用,是人體必須的微量物質之一。體、內外實驗表明,維生素E 是非常重要的阻斷自由基鏈式反應的抗氧化劑,不但能夠預防和減輕體內細胞膜脂質過氧化物的破壞,保持組織的完整性,而且在生命活動中起著極其重要的作用,具有防癌、抗衰老等功能。維生素E 由8 種異構體構成,其中α-生育酚的生理活性和抗氧化能力最強。近幾年已應用維生素E 作為一些疾病輔助治療及抗衰老的藥物,市場上維生素E 制品基本以α-生育酚醋酸酯形式出現。目前維生素E 的測定方法主要包括氣相色譜法［1,2］、高效液相色譜法［3-5］、紫外光譜法等［6］。紫外光譜法專屬性不強,故使用導數光譜法,但操作非常復雜。近年來國內外多采用專屬性強、簡便快速的色譜法測定,中國藥典中維生素E 及其制劑的測定方法為氣相色譜法。色譜法還可應用到血漿中維生素E 的測定中。本試驗擬比較毛細管氣相色譜法和高效液相色譜法測定人血漿中維生素E 濃度的準確性、靈敏度等,確定適用于維生素E 血藥濃度監測的方法并探討其原因?，F報告如下。

1 儀器與試藥

GC-2010 氣相色譜儀包括氫火焰離子化檢測器,Labsolutions GC solution 色譜工作站(日本島津)。LC-10A 高效液相色譜儀包括SPD-10A 紫外檢測器,Chromato-solution Light 色譜工作站(日本島津)?？瞻籽獫{由廈門市中心血站提供。維生素E 對照品(98.9%)為蒂斯曼(上海)有限公司產品,正三十二烷(99.9%)為日本東京化成工業株式會社產品。實驗用水為去離子水,甲醇為色譜級試劑,正己烷、無水乙醇等為分析純試劑。

2 方法與結果

2.1 測定方法

2.1.1 氣相色譜法 色譜柱為Rtx-1 毛細管柱(30.00 m×0.25 mm,0.25 μm),載氣為氮氣,流速為10 ml/min,氣化室溫度為300℃,柱溫為290℃,FID 溫度為300℃。精密量取100 μl 血漿,置塑料離心管中,分別加入150 μl 水和350 μl 無水乙醇,渦旋1 min,精密加入500 μl 內標溶液(取正三十二烷適量,精密稱定,加正己烷溶解,稀釋成10 μg/ml 的內標溶液),渦旋1 min 后,于4000 r/min 離心5 min,吸取上清液,氮氣吹干,精密加入100 μl 正己烷,渦旋混勻1 min,于10000 r/min 離心3 min,取2 μl 上清液注入氣相色譜儀進行分析。

2.1.2 高效液相色譜法 色譜柱為島津VP-ODS C18柱(250.0 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇,流速為1.5 ml/min,檢測波長為254 nm,柱溫為室溫。精密量取100 μl 血漿,置塑料離心管中,分別加入150 μl 水和350 μl 無水乙醇,渦旋1 min,加500 μl 正己烷,渦旋1 min 后,于4000 r/min 離心5 min,吸取全部上清液,氮氣吹干,精密加入100 μl 甲醇,渦旋混勻1 min,于10000 r/min 離心3 min,取10 μl 上清液注入液相色譜儀進行分析。

2.2 標準溶液的配制 取維生素E 對照品12.5 mg,精密稱定,置50 ml 容量瓶中,加無水乙醇溶解,稀釋至刻度,搖勻,即得0.25 mg/ml 的維生素E 貯備液,置冰箱中保存。臨用時精密吸取貯備液,用無水乙醇稀釋至刻度,配制成系列標準溶液。

2.3 專屬性試驗 取兩份空白血漿100 μl 按兩種前處理方法操作,另取兩份空白血漿80 μl,精密加入維生素E 標準溶液20 μl,渦旋混勻,分別按兩種前處理方法操作,在各自的色譜條件下血漿內源性物質不干擾藥物的測定,專屬性較好。氣相色譜條件下,維生素E 的保留時間(tR)為17.4 min,內標tR為17.9 min,兩者分離度為1.4。高效液相色譜條件下,維生素E 的tR為11.55 min。見圖1。

圖1 氣相色譜法和高效液相色譜法的色譜圖

2.4 標準曲線 取塑料離心管數支,加入空白血漿80 μl,分別精密加入維生素E標準溶液20 μl,渦旋混勻,配制系列含藥血漿。其血漿藥物濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/ml。分別按兩種前處理方法操作,在各自的色譜條件下進樣,記錄色譜圖。

氣相色譜法以維生素E 的濃度C 為橫坐標,維生素E 的峰面積As 與內標物的峰面積Ar 的比值f為縱坐標,求回歸方程,標準曲線為f=0.039C+0.005,r=0.9985,在0.5～10.0 μg/ml 范圍內線性關系良好。根據信號噪音比值,得血漿中最低定量限為0.501 μg/ml,相對標準偏差(RSD)為11.3%(n=5)。高效液相色譜法以維生素E 的濃度C 為橫坐標,峰面積A 為縱坐標,求回歸方程。由于靈敏度較低,血漿藥物濃度兩個低濃度點沒有信號,故未計算標準曲線。

2.5 提取回收率試驗 取空白血漿80 μl,精密加入不同濃度的維生素E標準溶液,使其成為血漿藥物濃度為0.8、2.5、10.0 μg/ml 的低、中、高三種濃度的血漿樣品,每個濃度平行配制6 份,分為兩組,分別按兩種前處理方法操作,在各自的色譜條件下進樣,記錄色譜圖。

用氣相色譜法時計算維生素E 峰面積As 與內標的峰面積Ar 的比值f。另取塑料離心管數支,分別精密加入相應濃度的維生素E 溶液,內標溶液500 μl,氮氣吹干,再精密加入100 μl 正己烷,渦旋混勻1 min,于10000 r/min 離心3 min,取上清液2 μl 進樣,計算維生素E 峰面積As’與內標的峰面積Ar’的比值f’。以f 與f’之比計算提取回收率。高效液相色譜法的維生素E 峰面積為A,另取塑料離心管數支,分別精密加入相應濃度的維生素E 溶液,氮氣吹干,精密加入100 μl 甲醇,渦旋混勻1 min,于10000 r/min 離心3 min,取上清液10 μl 進樣,維生素E 峰面積為A’。以A 與A’之比計算提取回收率。結果見表1,氣相色譜法提取回收率較好,高效液相色譜法的提取回收率低,影響方法的準確度。

表1 回收率試驗結果(n=3)

2.6 氣相色譜法精密度試驗 取空白血漿80 μl,精密加入不同濃度的維生素E 標準溶液,使其成為血漿藥物濃度為0.8、2.5、10.0 μg/ml 的低、中、高三種濃度的血漿樣品,每個濃度平行配制3 份,共9 份作為一批,在同日內按氣相色譜法的前處理方法和色譜條件測定,計算日內精密度。連續3 d,重復同樣的操作,測定三批血漿樣品,計算日間精密度。結果見表2,RSD均＜15%,分析精密度良好。

表2 精密度試驗結果(n=3)

2.7 氣相色譜法穩定性試驗 將血漿樣品在-20℃冷凍前、冷凍24 h 后于室溫自然解凍、室溫放置8 h、冷凍30 d 以及在-20℃和室溫下反復凍融3 次后按氣相色譜法的前處理方法和色譜條件測定,計算血漿藥物濃度。結果維生素E 含量基本不變,表明血漿中維生素E 在-20℃冷凍儲存、解凍8 h 以及反復凍融的情況下是穩定的。

3 討論

本試驗比較了兩種測定血漿中維生素E 的方法,從結果上看氣相色譜法優于高效液相色譜法。分析其原因,認為是血漿樣品的前處理方法以及定量方法造成的。血漿樣品的分析一般采取一次萃取的方式,故提取率不高。本試驗中高效液相色譜法的定量方法是外標法。外標法簡便,但進樣量須十分準確,并且前處理方法必須能夠完全將藥物從基質中提取出來,否則將會造成分析方法誤差,得不到準確的測量結果。高效液相色譜法本身的進樣是準確的,但在該血漿樣品的前處理時損失了藥物,最終該方法的準確度低。RSD值偏大,說明提取效果不穩定。本試驗的另一方法氣相色譜法使用內標法定量,即在分析測定時,從樣品的前處理開始加入一內標物,通過測量被測組分及內標物的峰面積的比值來進行計算,以消除操作條件(包括萃取、進樣等操作)的波動對分析結果產生的影響,提高分析結果的準確度。由于氣相色譜法本身進樣的不準確性,一般采用內標法定量。在本試驗中,內標的使用同時還消除了萃取過程的誤差,所以氣相色譜法回收率、精密度等指標均符合要求。由于氣相色譜法更適合該樣品的測定,本試驗重點研究了氣相色譜法的測定條件,具體如下。①維生素E 是弱極性化合物,選用中等極性色譜柱時藥物和內標不能完全分離。隨后選用非極性色譜柱,維生素E 與固定相有較強的親和力,雖然延長了分析時間,但內源性物質、藥物和內標都能達到基線分離,效果較好。②柱溫的選擇參照中國藥典2015 版二部,在265℃下,20 min 內沒有出峰。試驗考察了270、280、290、300℃時的色譜分離情況,最終確定柱溫為290℃。③血漿樣品處理時加入水和乙醇的作用是沉淀血漿中的蛋白,再加正己烷萃取血漿中的維生素E。血漿樣品萃取后,曾經選擇無水乙醇將殘渣溶解,但實驗結果表明重現性較差,因正三十二烷為非極性物質,在無水乙醇中不能完全溶解,在用無水乙醇復溶時,離心管內壁上附有少量白色物質。最后改用正己烷復溶,能完全溶解殘渣。

本試驗中的毛細管氣相色譜法采用正己烷對血漿樣品進行萃取,與固相萃取法比較費用低,操作簡便易行,具有選擇性強,靈敏度高,簡便、快速、準確的特點,可用于維生素E 藥動學研究和血藥濃度檢測。