沉默內源性RNF4 通過激活p53 通路誘導乳腺癌細胞凋亡

余思茗 張玥 王婷婷

乳腺癌(Breast Cancer)居全世界女性癌癥發病率首位,是危害女性生命和健康的最嚴重的惡性腫瘤之一［1］。大多數乳腺癌是一種激素依賴性的高度異質性實體瘤,預后較差,利用免疫組化進行分子分型,根據不同分型給予個性化治療方案對于治療乳腺癌尤為重要［2］。因此深入探究乳腺癌發生發展的機理,給患者有效的治療手段,仍是醫學研究的重要課題之一。蛋白質翻譯后的修飾(post-translational modifications),如磷酸化修飾、泛素化修飾、SUMO 化修飾等,可調控相關致癌因子的降解和活性,因此對于腫瘤的發生、發展至關重要［3］。RNF4 作為一種靶向SUMO 鏈的泛素連接酶,可通過與多種致癌因子的磷酸化形式結合,增強c-Myc、c-Jun 等致癌因子的穩定性和活性,促進腫瘤生長［4,5］。同時,RNF4 的活性也與多種癌癥高度相關。在30%的結腸腺癌患者樣本中,RNF4 蛋白水平顯著升高,并且高水平的RNF4 mRNA 與乳腺癌患者的低生存率也密切相關［5］。故本研究旨在探討沉默內源性RNF4 對乳腺癌細胞生長的抑制作用及相關的分子機制,并且利用在體裸小鼠乳腺癌模型印證RNF4 作為治療乳腺癌的潛在藥物靶點的可能性。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗細胞和動物 人乳腺癌 MCF-7 細胞株購自北京中國醫學科學院基礎醫學研究所；實驗動物來源：成年Nu/Nu 裸鼠,體重18～20 g,雌性,通過本院實驗中心外購,并寄養。

1.2 構建RNF4 沉默的穩轉細胞株 ①選擇靶序列：RNF4 shRNA 干擾序 列：5'-GatccGGAAACTGTTGGA GATGAATTCAAGAGATTCATCTCCAACAGTTTCCTT TTTTg-3',3'-AattcAAAAAAGGAAACTGTTGGAGATG AATCTCTTGAATTCATCTCCAACAGTTTCCg-5'；②包裝慢病毒：插入RNF4 shRNA 干擾序列的慢病毒載體LV-3(pGLVH1/GFP+Puro)由上海吉瑪基因公司制備。取對數生長期人乳腺癌細胞MCF-7 種于6 孔板中,5×105個/孔,每孔加2 ml 含10%牛血清DMEM培養基,置于37℃、5% CO2培養箱進行培養,待細胞貼壁后進行實驗。細胞融合度約達到80%時,按照 Lipofectamine2000 轉染試劑說明書進行轉染操作,將 shRNA RNF4 陰性對照質粒和 shRNA RNF4 包裝質粒分別轉染到 MCF-7 細胞中,6 h 后換用完全培養基,繼續48 h 后,檢測 RNF4 表達情況,鑒定轉染結果；③感染慢病毒：6 孔板中,5×105個/孔,生長至約60%～80%時棄DMEM,每孔加入不同慢病毒［包括空白和目的表達載體,感染復數(MOI)=30］再加入含凝聚胺(6～8 μg/ml)的培養基,繼續培養24 h；吸棄含有慢病毒培養液,加入DMEM 繼續培養,并在感染后每隔一定時間觀察細胞狀態。④篩選穩轉細胞株：慢病毒感染48 h 后,將 DMEM 更換為2 μg/ml 嘌呤霉素培養液；2 d 更換一次培養液,待細胞生長穩定后傳代；超過兩代后無需再加嘌呤霉素培養；經RNF4 表達驗證后,得到RNF4 沉默的穩轉細胞株。

1.3 裸鼠皮下移植瘤模型 將對數生長期的、慢病毒轉染建立的穩定沉默RNF4 的MCF-7 細胞系與陰性空載質粒轉染的細胞系用胰酶消化收集,并用氯化鈉注射液洗滌重懸,懸液濃度5×107個細胞/ml,將0.2 ml 的腫瘤細胞懸液于異氟烷吸入麻醉下注射于裸鼠右腋皮下。裸鼠蘇醒后送入鼠房,自由飲食。每3 天測量一次皮下移植瘤體積,連續觀察26 d 后,脫臼法處死裸鼠,提取腫瘤組織,拍照、稱重并提取腫瘤組織總蛋白,備用。

1.4 Western blot 檢測RNF4 和p53 表達水平 取小鼠瘤組織或離體培養的細胞,提取樣品總蛋白,依據BCA 蛋白濃度檢測試劑盒中的說明書,測定蛋白濃度。將處理好的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)實驗,之后將蛋白條帶印跡到PVDF 膜上,脫脂牛奶室溫封閉2 h 后,孵育一抗：RNF4、GAPDH 和p53,4℃過夜。次日PBST 緩沖液 洗滌后,加入羊抗兔或鼠二抗室溫避光孵育 1 h。

1.5 CCK-8 檢測細胞活性 取對數期MCF-7 細胞種于96 孔板,3000 個/孔,置于37℃、5% CO2培養箱培養24 h。培養結束后加入10 μl 的CCK-8 反應液,避光在培養箱中孵育1 h。用酶標儀在 460 nm 波長下檢測吸光度值。

1.6 主要試劑和儀器 DMEM 細胞培養基和胎牛血清購自美國 Gibco 公司；shRNA RNF4 干擾質粒及其陰性對照質粒購自廣州銳博生物科技公司；Lipofectamine 2000 試劑購自美國ThermoFisher 公司；CCK-8 試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；RNF4 一抗、GAPDH 一抗、p53 一抗購于美國Proteintech 公司；二抗羊抗鼠、二抗羊抗兔購自美國ThermoFisher 公司。

1.7 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行圖表制作與數據統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,腫瘤體積=1/2ab2(a=腫瘤長徑,b=腫瘤短徑)。多組比較應用單因素方差分析法(One-way ANOVA)并用Turkey 法驗證；兩組比較應用t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LV3(H1/GFP&Puro)慢病毒穩定沉默RNF4 的乳腺癌細胞系 通過0.5、1.0、1.5、2.0 和 2.5 μg/ml 的嘌呤霉素培養基進行篩選出穩定沉默的細胞系,與對照組(shCtl)相比,RNF4 沉默組(shRNF4)中RNF4 表達明顯降低,說明穩轉細胞系建立成功。見圖1。

圖1

2.2 沉默內源性RNF4 對于腫瘤細胞活性影響 CCK8實驗結果顯示,與shCtl 組相比,shRNF4 組癌細胞的增殖活性被顯著抑制,表明沉默內源性RNF4 可抑制乳腺癌細胞增殖。見圖2。

圖2

2.3 沉默內源性RNF4 對于乳腺癌細胞中促凋亡蛋白p53 的影響 與shCtl 組相比,shRNF4 組中p53 表達顯著升高,表明沉默RNF4 是通過激活p53 凋亡通路起到抑制乳腺癌細胞生長的作用。見圖3。

圖3

2.4 沉默內源性RNF4 對于荷乳腺癌裸小鼠模型生長的影響 連續觀測裸鼠皮下腫瘤生長26 d,各組均未出現動物死亡。與shCtl 組相比,shRNF4 組腫瘤生長緩慢,沉默內源性RNF4對腫瘤體積和重量有明顯的抑制作用,腫瘤體積抑制率為55.3%,瘤重抑制率為60.9%。見圖4。

圖4

2.5 沉默內源性RNF4 對于乳腺癌組織中促凋亡蛋白p53 的影響 與shCtl 組比較,沉默RNF4 后,瘤組織中的p53 表達增加,與離體實驗結果一致,說明沉默RNF4 是通過上調促凋亡蛋白p53 的表達,激活相關凋亡通路,從而抑制體乳腺癌的生長。見圖5。

圖5

3 討論

乳腺癌作為危害女性健康的“第一殺手”,在臨床中的治療尚缺乏有效的措施且患者預后差［6］。已有研究表明高水平的RNF4 mRNA 與乳腺癌患者的預后差、低生存率密切相關［5］。因而,本實驗通過沉默乳腺癌細胞內源性RNF4 發現,促凋亡蛋白p53 表達升高,在體模型中腫瘤生長緩慢,腫瘤體積和重量均顯著減少,腫瘤細胞活性被顯著抑制,提示RNF4 可能作為治療乳腺癌的潛在靶點。

p53 是關鍵的抑癌基因,其編碼的蛋白質調控著細胞生長、發育、新陳代謝、凋亡、氧化應激、DNA損傷修復等過程,同時也作為轉錄激活因子促進下游基因表達,從而達到抑制腫瘤進程的作用［7］。p53 基因突變常見于腫瘤患者中,可導致DNA 損傷修復途徑的失靈、細胞周期阻滯等,增強腫瘤細胞的侵襲、轉移和耐藥性,加速腫瘤進程［8］。

RNF4 作為靶向SUMO 鏈的泛素連接酶,可調控底物蛋白發生降解,參與核酸的代謝、胚胎發育、轉錄、DNA 修復及穩定性等重要細胞活動［9］。研究表明,RNF4 是促癌因子c-Myc 的重要靶點。當Wnt 或Notch通路激活時,RNF4 的表達也隨之升高［10］。與此同時,RNF4 不僅沒有促進相關致癌蛋白發生降解,反而穩定了多種存活周期較短的致癌蛋白,如β-Catenin、c-Myc、c-Jun 等的表達,并且增強它們的轉錄活性［5］。因此,抑制RNF4 的活性和表達可能會成為癌癥治療的有利手段。故本研究通過探討RNF4 沉默是否通過抑制p53 通路發揮促進乳腺癌細胞凋亡的作用,為臨床靶向治療乳腺癌提供更多理論基礎。

綜上所述,本實驗通過沉默RNF4,從而激活p53通路,誘導乳腺癌細胞凋亡并且抑制在體乳腺癌的生長,揭示RNF4 可作為潛在的治療靶點。