外泌體circRNA 在肝癌中的作用及其分子機制研究

趙彥龍，謝澤偉，趙守和，馬森

（深圳市坪山區人民醫院 普外科，廣東 深圳 518118）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，位居死因第二位，其發病率與死亡率一直居高不下［1］。我國目前主要采用B 超檢查和血清甲胎蛋白（AFP）進行肝癌篩查和診斷，然而有報道［2］顯示該方法的敏感度存在差異且具有局限性，很多早期肝癌未能及時發現。circRNA 是一種非編碼RNA，具有閉環結構，目前已有研究［3］表明多種circRNA 可作為肝癌診斷的標志物。外泌體是一種可來源于多種細胞的膜性囊泡，通過傳遞細胞間物質信息，調節腫瘤的微環境，進而在腫瘤的發生發展中發揮重要作用［4］。本研究探討外泌體circRNA 在肝癌中的作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本本研究收集2019 年1 月至2020 年8 月在我市某院經病理檢查確診的20 例原發性肝癌患者的手術切除的廢棄標本，包括肝癌患者腫瘤組織以及腫瘤邊緣5 cm 處的癌旁組織。排除具有嚴重心血管疾病、肝腎功能不全、腫瘤、免疫系統疾病的患者的組織，納入患者均已知曉手術標本用途并簽訂知情同意書。

1.2 外泌體提取與鑒定將所得腫瘤組織及癌旁組織存放于無血清培養基進行培養。收集細胞培養上清液，以2 000 ×g 離心30 min 并去除雜質，在4 ℃條件下孵育0.5 h，繼續以10 000 ×g 離心10 min，沉淀用PBS 重懸，即可獲得外泌體懸液，并在電鏡下觀察外泌體形態。

1.3 QGY－7703 和SMMC－7721 細胞培養轉染QGY－7703 和SMMC－7721 肝癌細胞采用DMEM 培養基進行培養，當細胞生長密度達90%時，根據試劑說明書將circ－CDYL 或siRNA 轉染至細胞內。

1.4 細胞增殖實驗實驗分為對照組、circ－CDYL 低表達及高表達組，采用CCK－8 試劑盒檢測細胞增殖。QGY－7703 和SMMC－7721 細胞培養48 h 后加入CCK－8 試劑，隨后培養2 h采用酶標儀測定吸光度。

1.5 細胞侵襲能力將Transwell 小室用Matrigel 基質膠進行包被，用以檢測細胞侵襲能力。實驗分為對照組、circ－CDYL 低表達及高表達組。將無血清細胞懸液加至Transwell 室上部，將含10%血清的培養基加入下部，培養24 h 后用甲醇固定30 min，并用結晶紫染色鏡下觀察。

1.6 統計分析采用SPSS 22.0 統計軟件處理數據，計量資料用均數± 標準差表示，組間比較采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織中差異表達最顯著的circRNA 為circ－CDYL本研究采用環狀RNA 芯片，對比分析20 例肝癌患者的腫瘤組織及癌旁組織中circRNA 的表達譜，結果顯示，癌旁組織與腫瘤組織中差異表達的circRNA 有161 種，其中circ－CDYL 差異表達最為顯著。

2.2 轉染后QGY－7703 和SMMC－7721 細胞外泌體中circ－CDYL 的表達水平在QGY－7703 轉染后，穩定過表達circ－CDYL 的細胞外泌體中的circ－CDYL 含量較穩定干擾的更多；同樣的結果在SMMC－7721 細胞中也可觀察到，穩定過表達circ－CDYL 的細胞外泌體中circ－CDYL 的含量均顯著較高，穩定干擾的表達則較低。見表1。

表1 轉染過表達及干擾載體的QGY－7703 和SMMC－7721 細胞外泌體中circ－CDYL 的表達水平（）

表1 轉染過表達及干擾載體的QGY－7703 和SMMC－7721 細胞外泌體中circ－CDYL 的表達水平（）

2.3 circ－CDYL 對肝癌細胞增殖及侵襲能力的影響在QGY－7703 和SMMC－7721 細胞轉染后，與circ－CDYL 高表達的細胞外泌體相比，circ－CDYL 低表達的細胞外泌體與肝癌細胞共培養后，細胞增殖和侵襲受到抑制。見表2。

表2 QGY－7703 和SMMC－7721 細胞轉染后侵襲數量與CCK－8 結果（）

表2 QGY－7703 和SMMC－7721 細胞轉染后侵襲數量與CCK－8 結果（）

3 討論

外泌體（exosomes）是一種膜性囊泡，直徑為40～100 nm，它可由B 細胞、T 細胞、樹突細胞、血小板以及肥大細胞等不同細胞分泌。研究［5］表明，外泌體可傳遞細胞間的物質信息，調控腫瘤內部的微環境，這在腫瘤的發生發展中具有重要作用。近年來，越來越多的研究開始關注到環狀RNA（circRNA），有研究［6］發現circRNA 在細胞的各項生命活動中均發揮重要作用，且circRNA 表達譜在腫瘤患者的腫瘤細胞與癌旁組織來源細胞間具有顯著差異，這可能與腫瘤的發生發展密切相關。目前已發現的與腫瘤相關的circRNA 較多，circPVT1在胃癌組織中的表達量高于癌旁組織，可促進癌細胞增殖；circ0000096 在抑制胃癌細胞的增殖和轉移中也發揮著重要的作用［7］。CiRS－7 在肝癌組織中含量較高，可增強肝癌細胞的增殖和侵襲能力。另有研究［8］表明，circRNA＿0007874 和circRNA＿104135 在肝癌組織中顯著下調，可抑制肝癌進展。目前已有研究［9］表明，外泌體在肝癌的發生發展中承擔著不可或缺的重要角色。外泌體的深入研究對于肝癌的篩查、診斷、分期、預后判斷及治療均有重要意義。

本研究探討外泌體circRNA 在肝癌發生發展中的作用。首先通過基因芯片鑒定腫瘤組織與癌旁組織中circRNA 的表達差異，結果顯示circ－CDYL 是差異最為顯著的circRNA。CDYL基因位于Y 染色體上，該基因編碼表達的蛋白質主要功能是調控神經系統生長發育及抑制基因轉錄等［10］。據此，本研究以circ－CDYL 為靶點，進一步探討其在肝癌中的作用，構建circ－CDYL 過表達載體及干擾載體，在QGY－7703 和SMMC－7721兩種肝癌細胞中轉染，隨后提取外泌體并檢測其中circ－CDYL的表達水平，結果顯示穩定過表達circ－CDYL 的細胞外泌體中circ－CDYL 的含量顯著較高。采用Transwell 小室檢測細胞侵襲力，circ－CDYL 高表達組的細胞侵襲力更高。CCK－8 實驗結果也表明circ－CDYL 能夠增強肝癌細胞的增殖活性。

綜上，外泌體circ－CDYL 可增強肝癌細胞增殖及侵襲的活性，從而促進肝癌細胞的轉移及發展，關于其具體的作用機制需要開展進一步的研究。