UPLC-MS/MS法測定番茄醬中5種鏈格孢霉毒素

王遠 ，邢麗杰 ，李先義，羅瑞峰，劉玉晗

1.新疆農墾科學院（石河子 832000）；2.石河子大學食品學院（石河子 832000）

番茄醬是生活中必不可少的調味品之一，它能大大提高食品的美味。新疆是生產番茄醬的主要產地，產量占全國的90%以上，并且出口總量達100多萬 t。鏈格孢菌是一種廣泛分布在蔬菜上的腐生、內生和致病性菌株，其在低溫、潮濕的環境下生長繁殖，是導致蔬菜腐爛變質的主要微生物[1]。鏈格孢菌可產生70多種有毒代謝產物，統稱為鏈格孢霉毒素[2-3]，其具有細胞毒性、基因毒性以及急性毒性，會對人體健康產生危害[4-5]。Sanzani等[6]對意大利南部阿普利亞地區的新鮮和干燥番茄樣品進行了鏈格孢毒素檢測，結果表明新鮮和干燥的番茄中均存在細交鏈格孢菌酮酸（tenuazonic acid，TEA），且干番茄受污染程度高于新鮮番茄。Puntscher等[7]對奧地利的番茄醬進行檢測，結果表明番茄醬中含有鏈格孢酚（alternariol，AOH）、交鏈格孢酚單甲醚（alternariol monomethylether，AME）、細交鏈孢菌酮酸（TEA）和騰毒素（tentoxin，TEN）。目前從食物中檢出的鏈格孢菌毒素主要有騰毒素（TEN）、鏈格孢霉素（alternaria，ALT）、交鏈格孢酚單甲醚（AME）、鏈格孢酚（AOH）以及細交鏈格孢菌酮酸（TEA）。

我國尚未針對番茄醬建立鏈格孢霉毒素的限量標準和檢測方法。現有文獻資料報道的鏈格孢霉毒素的定量方法主要有氣相色譜-串聯質譜法[8]、高效液相色譜法[9-10]和液相色譜-串聯質譜法[11-13]。其中氣相色譜-串聯質譜法前處理需要進行衍生化處理，過程復雜。高效液相色譜法分離速度快，但是抗干擾差，存在一定假陽性。液相色譜-串聯質譜法具有準確度高、靈敏度高、穩定性好等特點，成為復雜食品分析的主要方法。近年來QuEChERS前處理凈化技術以其快速、溶劑使用量少和操作簡單等特點被廣泛應用于復雜樣品的前處理[14-15]。試驗以番茄醬為基質，研究QuEChERS方法中不同凈化劑的凈化效果，建立番茄醬中鏈格孢霉毒素的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）測定方法，為番茄醬中鏈格孢霉毒素的檢測提供技術方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲酸、乙腈、甲醇（HPLC純，德國CNW公司）；C18吸附劑、PSA吸附劑、GCB吸附劑、無水硫酸鎂、氯化鈉（德國CNW公司）；騰毒素（TEN）、鏈格孢霉素（ALT）、鏈格孢酚甲基乙醚（AME）、鏈格孢酚（AOH）、細交鏈格孢菌酮酸（TEA）5種ATs標準品（純度均大于99%，德國Dr公司）。

1.2 儀器與設備

Waters XEVO TQ-S超高效液相色譜-串聯質譜儀（美國Waters公司）；Sigma 3-30k型離心機（德國Sigma公司）；MS3-basic型漩渦混合器（德國IKA公司）；N-EVAPTM112型氮吹儀（美國Organomation公司）；KQ-600DE型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器公司）；ULPHW-IV型超純水機（四川優普超純科技有限公司）。

1.3 儀器參數

色譜條件：BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；流速為0.4 mL/min；梯度洗脫：0～0.5 min，95%（A）；0.51～5 min，95%～5%（A）；5.01 min，95%（A）；柱溫30 ℃；進樣體積5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子和多反應監測（MRM）模式，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流速為50 L/h，氬氣作為碰撞氣。5種鏈格孢菌毒素在多反應監測模式下質譜參數見表1。

表1 多反應監測離子對及質譜條件

1.4 樣品處理

準確稱取5.00 g番茄醬樣品于50 mL離心管中，向離心管中分別加入2 mL水和10 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取20 min；然后加入1 g NaCl充分振搖，使其NaCl完全溶解后（使水相與乙腈相分層），以10000 r/min高速離心5 min。準確移取2 mL上清液于預先盛有0.5 g MgSO4和100 mg C18吸附劑的10 mL離心管中，渦旋混勻，在5000 r/min下離心3 min，取1 mL凈化液在40 ℃下氮吹干，用1 mL乙腈水（體積比，1+1）溶液定容，過0.22 μm有機濾膜，供UPLC-MS/MS分析。

1.5 線性范圍及檢出限

鏈格孢菌毒素單標儲備液的配制：準確稱取每種鏈格孢菌毒素的單個標準品，用乙腈溶解配制成質量濃度為1 mg/mL的溶液（-20 ℃保存）。

5種鏈格孢菌毒素混合標準溶液的配制：分別準確量取適量5種鏈格孢菌毒素標準儲備液，用50%乙腈水溶液逐步稀釋成0.5，1，2，5，10，20，50，100和200 ng/mL的系列標準混合工作液。按照1.3小節確定的儀器參數進行測定，以質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行線性擬合，分別得到5種鏈格孢菌毒素的線性方程和相關系數。同時分別計算3倍和10倍信噪比所對應的濃度，作為方法的檢出限和定量限。

1.6 準確度及精密度

為了考察方法的準確度和精密度，選取2個陰性番茄醬樣品進行加標回收試驗，進行低、中、高3個水平的添加試驗，每個添加水平連續重復測定6次。按照1.4小節的方法進行樣品前處理，在1.3小節確定的色譜和質譜條件下測定，計算加標樣品的回收率和相對標準偏差。

2 結果與討論

2.1 色譜-質譜分析2.1.1 質譜參數的優化

分別配制質量濃度為1 μg/mL的5種鏈格孢菌毒素單個標準溶液，采用intellistart和手動優化結合的方法，對每種鏈格孢菌毒素的離子模式（正/負）、母離子（錐孔電壓）、子離子（碰撞能量）等參數進行選擇優化，得到騰毒素、鏈格孢霉素、交鏈格孢酚單甲醚、鏈格孢酚及細交鏈格孢菌酮酸的最佳質譜參數（見表1）。

2.1.2 分離條件的選擇

研究比較了不同有機相（甲醇和乙腈）與水相（添加甲酸）體系組成對5種鏈格孢菌毒素信號強度和分離效果的影響。結果發現，在水相流動相中加入甲酸（0.05%，體積分數）能有效地改善峰形，同時加入甲酸體系TEA的響應良好。而在沒有添加甲酸的流動相體系中TEA不出峰，這可能是由于甲酸的加入更有利于TEA的離子化。同時在甲酸水-乙腈流動相體系中5種鏈格孢菌毒素的信號強度高于甲酸水-甲醇流動相體系，且色譜系統的整體壓力較低。因此選擇甲酸水-乙腈體系作為測定選定5種鏈格孢菌毒素的流動相。進一步比較了水體系中不同甲酸添加量（0.05%，0.1%，0.2%，0.5%和1%）對5種鏈格孢菌毒素信號強度的影響。結果發現，5種鏈格孢菌毒素在0.1%甲酸水-乙腈流動相體系中回收率高于其他流動相體系（見圖1），故試驗選取0.1%甲酸水-乙腈體系作為分離5種鏈格孢菌毒素的流動相。

圖1 不同流動體系下5種鏈格孢菌毒素的比較

2.2 提取條件的選擇

研究結合文獻資料報道[1]選取乙腈作為提取溶劑，同時考察了乙腈中添加不同體積分數甲酸（0，0.5%，1%，1.5%和2%）對提取效率的影響，結果如圖2所示。純乙腈作為提取溶劑對5種ATs的提取效率最高，尤其是TEA。這與其他文獻報道的甲酸乙腈作為提取溶劑不一致，造成這一結果的原因可能是番茄醬本身在制作過程中呈酸甜味，本身已經具備酸性條件，所以乙腈直接作為提取溶劑對5種ATs的提取效率較高，并高于其他添加甲酸的提取溶劑。因此，試驗最終選取純乙腈作為最佳提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑下5種鏈格孢菌毒素的提取效率

2.3 凈化

研究考察了MgSO4、C18、PSA和GCB凈化吸附劑對番茄醬中5種ATs提取液的凈化效果。取2 mL待凈化液加入到預先分別裝有MgSO4（0.5 g）、C18（100 mg）、PSA（100 mg）和GCB（100 mg）的10 mL離心管中，同時加入10 ng ATs混合標樣，在優化的試驗條件下進行分析測定，結果如圖3所示。MgSO4、C18和PSA的凈化效果明顯好于GCB的凈化效果，GCB對5種ATs具有一定的吸附作用，尤其是對AME和AOH組分，幾乎全部吸附。同時由圖3可以看出，PSA吸附劑對AOH的影響較大，回收率低于70%，而MgSO4和C18吸附劑對5種ATs的凈化效果好，回收率均超過80%。因此，試驗選取0.5 g MgSO4和100 mg C18混合吸附劑作為凈化吸附劑。

2.4 線性相關性

在上述儀器條件下進行測定，采用外標法定量，以MS/MS定量離子色譜峰面積（y）對質量濃度（x）繪制標準曲線，并求出相應的線性回歸方程及相關系數。由表2可知，5種鏈格孢菌毒素在0.5～200 ng/mL質量濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數R2均在0.99以上。按3倍信噪比和10倍信噪比計算，5種鏈格孢菌毒素的檢出限均為1 μg/kg，定量限均為2.5 μg/kg。

表2 5種鏈格孢菌毒素的保留時間、線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

2.5 方法的準確度和精密度

按照1.6小節進行準確度和精密度試驗，計算加標回收率和相對標準偏差，結果如表3所示。由表3中回收率和SRSD數據可以看出，選取的2個陰性番茄醬樣品在3個添加水平下5種鏈格孢菌毒素的回收率在78.3%～104.8%之間，相對標準偏差在1.2%～7.4%之間，結果表明該方法測定分析的結果準確、可靠。同時該方法將保留時間和化合物碎片信息結合，進一步對化合物進行定性，這大大降低了檢測結果出現假陽性或假陰性的可能。

表3 5種鏈格孢菌毒素的準確度和精密度試驗結果（n=6）

2.6 實際樣品的測定

利用建立的方法對采自新疆石河子市面上的20個番茄醬樣品進行了5種鏈格孢菌毒素檢測。圖4分別是標準品（圖4a）和實際樣品（圖4b）的提取離子質譜圖。結果發現，在所有檢測的番茄醬樣品中，有部分樣品檢出TEA組分，質量分數在15～760 μg/kg之間。

圖4 5種鏈格孢菌毒素標準品和實際樣品的MRM圖

3 結論

試驗對液相條件、質譜條件、提取條件和凈化條件進行了優化，建立了超高效液相色譜-串聯質譜測定番茄醬中騰毒素、鏈格孢霉素、交鏈格孢酚單甲醚、鏈格孢酚及細交鏈格孢菌酮酸的方法。該方法前處理簡單，檢測時間短，結果靈敏度高，整體線性關系、準確度和精密度良好。運用該方法對購于新疆石河子地區市面上的20個番茄醬樣品進行測定，結果表明部分番茄醬樣品中含有TEA組分，質量濃度在15～760 μg/kg之間。該方法的建立為檢測番茄醬中鏈格孢菌毒素的檢測提供檢測依據，同時為檢測其他水果醬等制品中鏈格孢菌毒素的檢測提供技術參考。