密生波羅花中營養成分及抗氧化活性

李偉博，韓佳欣，何洋，周靜，紀麗蓮，胡衛成

1.新疆農業大學食品科學與藥學學院（烏魯木齊 830052）；2.淮陰師范學院生命科學學院，江蘇省環洪澤湖生態農業生物技術重點實驗室（淮安 223300）

藏藥密生波羅花（Incarvillra compacta）為紫葳科角蒿屬植物，是中國特有的草本植物[1]。其主要生長于海拔在2600～4100 m的甘肅南部、青海、西藏等地，與兩頭毛和西藏羅花共同作為傳統藥材“歐曲”，其花、根、種子均可入藥，主要治療高血壓、月經不調、胃痛、黃疸、消化不良，具有陣痛功效[2-3]。密生波羅花主要生長于空曠石礫山坡及草灌叢中，具有很強的滋補作用，常被當地人作為一種養身的保健藥材來食用。

目前為止，有關密生波羅花的研究主要集中在其化學成分及藥理活性方面。密生波羅花主要的化學成分包括單萜生物堿、環己乙醇、神經酰胺、香豆素和苯乙醇苷類等[4-5]。但目前還未見有關密生波羅花營養成分的報道。

此次試驗對密生波羅花的營養成分和體外抗氧化活性進行基礎研究，為保護和合理開發利用我國這一民族藥用植物資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

密生波羅花，青海省西寧市藥材市場經干燥的整株花；福林酚，索萊寶公司；?唑藍（MTT），賽國生物科技；二苯基苦味酰基苯肼（DPPH）、沒食子酸、生育酚、1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+），均為分析純，SIGMA公司；槲皮素、石油醚、無水乙醇、丙酮、硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、乙醚、氫氧化鉀、無水硫酸銅、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵，均為分析純，國藥集團。

1.2 儀器與設備

BS224分析天平，北京多利斯儀器系統有限公司；5810R臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；DI-220/KD-310全自動凱氏定氮儀，瑞典Opsis公司；RE-3000旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；Infinite M200 Pro酶標儀，瑞士Tecan；DK-8BD電熱恒溫水槽，上海精宏試驗設備有限公司；日立L8900氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

將密生波羅花在60 ℃干燥箱中干燥4 h，經粉碎機粉碎后過1 mm篩，放至干燥處保存，備用。

1.3.2 營養成分的測定方法

總糖的測定方法參照SN/T 4260—2015[6]，使用苯酚硫酸法測定；粗脂肪的測定參照GB/T 5009.6—2016[7]，使用索氏提取法；粗纖維的測定參照GB 5009.10—2003[8]，使用植物類粗纖維含量的測定方法；粗蛋白的測定參照GB/T 6432—2018[9]，使用凱氏定氮法測定；水分的測定參照GB/T 5009.3—2016[10]，使用直接干燥法測定；灰分的測定參照GB 2019.4—2016[11]，使用高溫灼燒法測定；氨基酸的測定參照GB 5009.124—2016[12]，使用日立L8900氨基酸分析儀測定。

1.3.3 乙醇提取物和水提取物的制備

精確稱取5 g密生波羅花粉末，以料液比1∶20（g/mL）的比例分別加入水和70%乙醇，在90 ℃水浴鍋中加熱3 h，過濾，旋蒸，冷凍干燥，分別獲得70%乙醇提取物和水提取物，放置干燥器中備用。

1.3.4 黃酮的測定

將0.3 mL 3%的NaNO2加入0.5 mL 80%乙醇，配制不同質量濃度的槲皮素標準溶液（0，25，50，100，200，300，400和500 μg/mL），混勻，避光靜置5 min，然后加入0.3 mL 10% Al(NO3)2和2 mL 4% NaOH，混勻，室溫靜置15 min后在510 nm處測其吸光度，重復3次。建立標準曲線，根據槲皮素的標準曲線，測得密生波羅花中黃酮的含量。

1.3.5 Fe3+能力的測定

參照景臨林等[13]方法，分別稱取10 mg密生波羅花的兩種提取物，用甲醇配制成0.25，0.5，1，1.5和2 mg/mL的溶液。分別取0.2 mL上述溶液，加入0.5 mL 0.2 mmol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 1%的鐵氰化鉀，渦旋混勻，于50 ℃孵育30 min，在冰上冷卻，加入0.5 mL 10%的三氯乙酸，渦旋混勻。取0.5 mL，加入0.5 mL純水和0.1 mL 1%的三氯化鐵，渦旋混勻，各取0.2 mL加入96孔板，重復3次，以VE作為標準參照物，用酶標儀在700 nm處測定吸光度。吸光度越大表示鐵還原能力越強。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定

參照張良等[14]方法，精確稱取7.88 mg DPPH溶于100 mL甲醇溶液中，得到0.2 mmol/L的DPPH溶液。分別取0.1 mL不同質量濃度的受試物（50，100，200，400和600 μg/mL）和0.1 mL DPPH加入96孔板中。按照上述方法，將DPPH與甲醇混合作為對照組，不同濃度的樣品液與甲醇混合作為空白組。以VE作為標準參照物，避光反應30 min，使用酶標儀在517 nm處測得吸光度。DPPH自由基清除率按式（1）計算。

式中：A1為DPPH甲醇溶液與甲醇溶液混合后的吸光度；A2為待測液與甲醇溶液混合后的吸光度；A3為DPPH甲醇溶液與甲醇混合后的吸光度。

1.3.7 MTT法檢測密生波羅花抗氧化應激能力

將PC12細胞接種于DMEM培養基中，在37 ℃，5%的CO2培養箱中培養，取適量對數生長期的PC12細胞，以3×105接種進96孔板，待細胞長至70%～80%，分別用乙醇提取物和水提取物以不同的質量濃度（12.5，25，50和100 μg/mL）處理細胞30 min，然后加入MPP+誘導細胞24 h，加入0.05 mL 1 mg/mL的MTT溶液，繼續培養2 h，吸去上清液，每孔加入0.1 mL異丙醇，振蕩10 min使紫色結晶充分溶解，在570 nm處測其吸光度。

1.4 數據統計分析

數據分析均使用Origin 8.0，SPSS 23軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 密生波羅花中的營養成分

由表1可知，密生波羅花中粗脂肪為5.33±1.15 g/100 g；粗蛋白為14.36±0.28 g/100 g；粗纖維為66.01±1.8 g/100 g；粗灰分為2.3±0.14 g/100 g；粗水分為4.88±0.3 g/100 g；總糖為1.77±0.09 g/100 g。

表1 密生波羅花中營養成分表

2.2 密生波羅花中氨基酸成分和質量分數的分析

由表2可知，密生波羅花中共含有17種氨基酸，總氨基酸質量分數為7.28%，其中必需氨基酸（EAA）共7種，質量分數為2.84 g/100 g，占總氨基酸（TAA）的39%；非必需氨基酸（NEAA）共10種，質量分數為4.442 g/100 g，占總氨基酸（TAA）的61%，EAA/NEAA為64%，均接近于FAO/WHO所推薦的EAA/TAA約為40%，EAA/NEAA約為60%的要求。

表2 密生波羅花中氨基酸含量

密生波羅花中藥用氨基酸共11種，質量分數為5.27 g/100 g，占總氨基酸（TAA）的72%。鮮味氨基酸共4種，質量分數為2.311 g/100 g，占總氨基酸的32%。其中谷氨酸最高，為1.044 g/10 g，占總氨基酸的14%，不僅為人類和動物提供了重要的營養物質，還可以和氨反應增加還原型谷胱甘肽的生成，促進抗氧化作用[16]。

2.3 呈味氨基酸分析

密生波羅花中呈味氨基酸分析見圖1。密生波羅花中谷氨酸和天冬氨酸總的質量分數為1.643 g/100 g，占總氨基酸的22.56%。谷氨酸呈酸性，天冬氨酸呈甜性，它們能很好地調和其他滋味，從而使藥物體現出微苦、微甘的口感。

圖1 密生波羅花中呈味氨基酸分析

2.4 密生波羅花中抗氧化活性的研究

2.4.1 密生波羅花中總黃酮的測定

密生波羅花總黃酮標準曲線方程為Y=0.0013X-0.0039（R2=0.9987），測得密生波羅花中總黃酮質量分數為6.78 g/100 g。

2.4.2 乙醇提取物和水提取物的制備

乙醇提取物和水提取物的得率如表3所示。結果表明，水提取物的得率明顯高于70%乙醇提取物的得率。

表3 密生波羅花提取物的得率

2.4.3 DPPH清除能力的測定[17]

如圖2所示，在相同提取條件不同提取溶液中，當質量濃度達到600 μg/mL時，乙醇提取物和水提取物對DPPH的清除能力基本一致，略高于VE對DPPH自由基的清除能力并且隨著濃度的增加保持穩定狀態。由此表明密生波羅花具有一定的DPPH自由基清除能力。

圖2 密生波羅花對DPPH自由基清除率

2.4.4 Fe3+還原能力的測定[18]

如圖3所示，隨著密生波羅花中提取物濃度的增加，其吸光度也呈上升趨勢。當乙醇提取物為1.5 mg時，與0.4 mg的VE的還原能力相同；當水提取物為0.25 mg時，與0.05 mg的VE的還原能力相同，由此表明密生波羅花具備一定的還原能力。

圖3 密生波羅花對Fe3+還原能力的測定

2.4.5 密生波羅花對MPP+誘導PC12細胞氧自由基損傷修復能力測定[19]

如圖4所示，與MPP+誘導組相比，低濃度的密生波羅花提取物處理組細胞存活率明顯升高。結果表明，密生波羅花能抑制MPP+誘導的PC12細胞損傷，具有一定的氧自由基修復能力。

圖4 密生波羅花對MPP+誘導PC12細胞氧自由基損傷修復能力測定

3 討論與結論

密生波羅花中營養成分含量較為豐富，其中粗蛋白、粗纖維含量較高，蛋白質是一切生命的物質基礎，缺少蛋白質可導致人體免疫力下降，粗纖維可以改善腸道蠕動，有助于人體腸道的消化。氨基酸含量的測定，體現出藥材的質量[20]，也是其營養價值的重要組成部分。密生波羅花中氨基酸成分比較全面，其中必須氨基酸占總氨基酸的39%，藥效氨基酸占總氨基酸的72%。呈味氨基酸所呈現的酸甜味，可以掩蓋其他的不良風味。

密生波羅花中水提取物的得率大于乙醇提取物的得率，可能是因為不同的提取溶劑造成的差異。氧自由基是人體代謝的產物，可造成生物膜系統損傷以及細胞內氧化磷酸化障礙，與人體疾病、衰老、死亡密切相關[21]。密生波羅花具有較好的抗氧化活性，密生波羅花中乙醇提取物和水提取物對DPPH自由基的IC50分別為93.1和184.13 μg/mL，0.25 mg的水提取物還原力相當于0.05 mg VE的還原能力，1.5 mg的乙醇提取物還原能力相當于0.4 mg VE的還原能力。隨著濃度的升高，乙醇提取物的抗氧化能力高于水提取物的抗氧化能力，可能是因為乙醇提取物中黃酮的含量比較高。Chavan等[22]的研究表明，黃酮是大多數植物提取物抗氧化的物質基礎，密生波羅花中黃酮含量比較豐富，可能是其發揮抗氧化的物質基礎，具體的化合物成分需要進一步的研究。

1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）是一種作為氧化應激的誘導劑，可引起PC12細胞氧自由基損傷[23]。密生波羅花乙醇提取物和水提取物在低濃度時表現出明顯的對MPP+引起的PC12細胞氧自由基損傷修復作用，但水提取物明顯高于乙醇提取物的氧自由基修復能力，可能是因為密生波羅花乙醇提取物的提取溫度過高造成的。薛長暉等[24]研究表明，提取液在提取過程中反應溫度過高會導致黃酮變質。結合抗氧化活性可以得出，密生波羅花提取物可通過兩種途徑對MPP+誘導PC12細胞造成的氧自由基損傷進行修復：一是直接清除氧自由基，減少自由基對蛋白、脂質、DNA的損傷；二是通過對細胞內抗氧化能力的改善和修復。

此次試驗對密生波羅花中營養成分、氨基酸及體外抗氧化活性進行了測定，結果表明，密生波羅花中營養成分豐富且氨基酸種類齊全，具有很好的抗氧化活性，而抗氧化活性是保健品的重要組成部分[25]。此次試驗為密生波羅花作為天然抗氧化劑用于保健品的開發利用指明了道路。