MTHFR基因多態(tài)性與兒童支氣管哮喘易感性及糖皮質(zhì)激素療效的相關(guān)性

李敏 湯昱 趙二要 陳超輝 董利利

（鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院東區(qū)呼吸科/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院，河南鄭州 450018）

支氣管哮喘是一種以呼吸道變應(yīng)性和非特異性高反應(yīng)為特征的慢性炎癥性疾病，發(fā)病具有多樣性和多變性，在兒童中發(fā)病率較高。近年來隨著環(huán)境質(zhì)量的降低，我國多個地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查顯示其發(fā)病率從2010年的3.02%左右上升至4%以上，甚至某些地區(qū)接近發(fā)達國家水平（9.36%~12.39%），嚴重威脅患兒身心健康［1-2］。目前，臨床主要采用控制性治療和緩解性治療兩種方式，其中糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）是主要的長期控制藥物。臨床調(diào)查顯示GC療效存在明顯的個體差異性［3］，其原因除了患兒耐藥性差異外還可能與患兒體內(nèi)GC受體異常表達或相關(guān)調(diào)控基因的多態(tài)性有關(guān)［4-5］。亞甲基四氫葉酸還原酶（methy‐lenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸代謝過程中的一種關(guān)鍵酶，有研究報道MTHFR不同基因型的酶活性存在顯著差異性［6］，因而與致病性有關(guān)。早期有研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C667T位點突變可能是兒童哮喘發(fā)生的獨立影響因素［7］，但由于哮喘的發(fā)生受地域、環(huán)境等多種因素影響，目前尚缺乏大量研究支持該論點。另有研究報道MTHFR基因多態(tài)性與甲氨蝶呤、來氟米特等藥物療效有關(guān)［8］，但與GC治療療效是否有關(guān)，是否會影響GC治療兒童哮喘的療效尚未可知。本研究擬通過檢測和比較支氣管哮喘患兒與健康兒童MTHFR基因C667T位點的基因型和等位基因頻率分布情況，探討MTHFR基因多態(tài)性與兒童支氣管哮喘易感性的相關(guān)性，并通過比較不同MTHFR基因型患兒GC的療效，初步探討MTHFR基因多態(tài)性與GC療效的相關(guān)性，從而為兒童支氣管哮喘的遺傳學(xué)研究和個體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取2018年6月至2020年12月在我院就診并住院治療的支氣管哮喘患兒為研究對象。納入標(biāo)準：（1）年齡0~14歲，戶籍所在地為河南省，漢族；（2）符合《支氣管哮喘防治指南（2020年版）》［9］中關(guān)于兒童支氣管哮喘的診斷標(biāo)準；（3）哮喘嚴重程度≥2級；（4）近4周內(nèi)未接受過GC局部或全身治療；（5）治療依從性良好，臨床資料完整。排除標(biāo)準：（1）既往有反復(fù)呼吸道感染史；（2）合并結(jié)核、肺炎及肝腎功能衰竭等其他疾病；（3）對本研究中的藥物過敏或有其他過敏史。最終納入173例支氣管哮喘患兒作為觀察組，其中男92例，女81例，年齡3~12歲，平均年齡（7.0±3.2）歲。同時隨機選取同期在本院體檢的無哮喘家族史及過敏史的健康兒童178例作為對照組，其中男100例，女78例，年齡3~12歲，平均年齡（7.4±3.1）歲。本研究經(jīng)鄭州兒童醫(yī)院倫理委員會批準（ZZUIRB2018‐0509），且所有受試兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 MTHFR C677T位點基因多態(tài)性檢測

所有受試兒均于采血前空腹6~8 h，采集靜脈血2 mL于抗凝管中，2 000 r/min離心，分離血清和血漿，分別于-20℃冰箱中保存待用。采用DNA提取試劑盒（美國Amresco公司）提取總DNA。根據(jù)NCBI基因庫中MTHFR（NC_000001.11：11785723‐11806103）基因序列設(shè)計PCR引物，上游：5'‐CCGCCGTGAACTACTGTGG‐3'；下游：5'‐AGATG‐GCCCGTGATCTCCTC‐3'。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性4 min；96℃變性45 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40個循環(huán)，室溫冷卻1 min。采用PCR純化試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）純化PCR產(chǎn)物，并將純化后的DNA片段于37℃恒溫箱中進行HinfI酶切反應(yīng)，4 h后對酶切產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠在90 V電壓下電泳30 min，溴化乙淀染色，利用凝膠成像系統(tǒng)對酶切產(chǎn)物成像觀察，鑒定基因型，統(tǒng)計兩組基因型的分布頻率。

1.3 治療方法

觀察組患兒根據(jù)病情嚴重程度給予常規(guī)止咳化痰、解痙平喘、維持電解質(zhì)及抗感染等對癥治療，嚴重者給予輔助吸氧。除以上常規(guī)治療外，霧化吸入糖皮質(zhì)激素布地奈德混懸液（瑞典AstraZeneca公司）治療，200~400μg/次，2次/d，10 min/次，連續(xù)治療3個月，治療期間根據(jù)病情嚴重程度按需吸入支氣管舒張劑硫酸沙丁胺醇溶液（澳大利亞GlaxoSmithKline公司）快速緩解。以上治療方案參照兒童支氣管哮喘防治常規(guī)中哮喘常用藥物及治療標(biāo)準［10］。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）一般資料：收集患者年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index,BMI）、病程等基礎(chǔ)資料。

（2）實驗室指標(biāo)：分別抽取治療前和治療3個月后患兒空腹靜脈血2 mL，采用全自動血液分析儀檢測兩組受試兒嗜酸性粒細胞計數(shù)（eosinophil count，EOS%），采用酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測兩組受試兒血清中白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）、免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、白細胞介素‐8（interleukin‐8，IL‐8）水平，操作嚴格按照說明書進行。

（3）肺功能指標(biāo)：治療前和治療3個月后，采用肺功能檢測儀（美邦）對受試兒肺功能進行測試，記錄受試兒第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1）、用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC），計算第1秒用力呼氣容積占用力肺活量的百分比（FEV1/FVC%）。

1.5 療效評價

3個月后觀察患兒喘息、咳嗽、氣促、哮鳴、胸悶等臨床癥狀改善情況，根據(jù)《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》［11］，評估患兒治療結(jié)束后4周內(nèi)的情況：喘息、胸悶等日間癥狀（<6歲：1次/周；≥6歲：2次/周）、夜間憋醒或咳嗽癥狀（<6歲：1次/周；≥6歲：2~3次/周）、應(yīng)急緩解藥物使用次數(shù)（<6歲：1次/周；≥6歲：2次/周）和活動能力受限。將療效分為控制良好：癥狀完全緩解，偶爾輕度發(fā)作且可自行緩解；部分控制：存在1~2項上述臨床癥狀；未控制：存在3~4項上述癥狀。其中控制良好視為療效良好，部分控制和未控制視為療效不良。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對所有數(shù)據(jù)進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）的形式表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗，組內(nèi)治療前后比較采用配對樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD‐t檢驗。計數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗，等級資料組間比較采用Kruskal‐WallisH非參數(shù)檢驗。應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗MTHFRC667T基因型頻率是否符合Hardy‐Weinberg平衡定律。采用logistic回歸分析支氣管哮喘易感性和GC療效敏感性的基因型。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy‐Weinberg平衡檢驗

經(jīng)Hardy‐Weinberg平衡檢驗，結(jié)果顯示兩組MTHFR基因C667T位點基因型的實際和理論頻率分布無差異，均符合遺傳平衡，具有群體代表性（P>0.05），見表1。

表1 MTHFR C667T位點基因型Hardy‐Weinberg平衡檢驗

2.2 兩組一般臨床資料及MTHFR C677T基因型分布情況

兩組兒童的年齡、性別和BMI比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。兩組基因型、等位基因分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；觀察組CC基因型頻率及C等位基因頻率均顯著低于對照組，TT基因型頻率及T等位基因頻率均顯著高于對照組（P<0.05）。見表2。

表2 兩組一般資料及MTHFR C667T基因型分布情況比較

2.3 MTHFR C677T基因型與支氣管哮喘易感性相關(guān)性

以是否發(fā)生支氣管哮喘為因變量（是=1，否=0），以年齡、性別、BMI、基因型或等位基因頻率為自變量進行l(wèi)ogistic回歸分析。其中基因型按CC、CT+TT進行分類，結(jié)果顯示CT+TT基因型的發(fā)病風(fēng)險是CC基因型的6.615倍（P<0.001）；攜帶T等位基因的發(fā)病風(fēng)險是攜帶C等位基因的7.055倍（P<0.001）。見表3。

表3 支氣管哮喘易感性的logistic回歸分析

2.4 不同基因型支氣管哮喘患兒GC治療前后指標(biāo)變化

實驗室指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，3種基因型患兒治療前血清IgE、IL‐8、LTB4水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。治療后3種基因型患兒血清IgE、IL‐8、LTB4水 平 均 顯 著 低 于 治 療 前（P<0.05）。與CC基因型相比，TT基因型患兒治療后血清IL‐8和LTB4水平顯著降低；與CT基因型相比，TT基因型患兒治療后血清LTB4水平顯著降低（P<0.05）。見表4。

表4 不同基因型患兒治療前后實驗室指標(biāo)比較 （±s）

表4 不同基因型患兒治療前后實驗室指標(biāo)比較 （±s）

注：［IgE］免疫球蛋白E；［IL‐8］白細胞介素‐8；［LTB4］白三烯B4。a示與CC基因型相比，P<0.05；b示與CT基因型相比，P<0.05。

基因型nIgE(IU/mL)IL‐8(ng/L)LTB4(ng/L)治療前 治療后t值P值 治療前 治療后t值P值 治療前 治療后t值P值CC21310±49159±2712.368<0.00127.8±5.620.5±3.25.054<0.001339±47175±4915.953<0.001 CT53317±48154±2322.295<0.00129.3±5.720.3±2.92.665<0.001316±50171±3916.647<0.001 TT99314±53151±3026.630<0.00130.1±6.118.9±2.9a16.573<0.001316±48156±35a,b33.106<0.001 F值0.1410.8301.4585.7892.0833.707 P值0.8680.4380.2360.0040.1280.027

肺功能檢測結(jié)果顯示，3種基因型患兒治療前肺功能指標(biāo)FEV1、FVC、FEV1/FVC%比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。治療后3種基因型患兒肺功能指標(biāo)均顯著高于治療前（P<0.05）。TT基因型患兒治療后FVC明顯高于CT基因型患兒，F(xiàn)EV1/FVC%顯著高于CC基因型患兒（P<0.05）。見表5。

表5 不同基因型患兒治療前后肺功能的比較 （±s）

表5 不同基因型患兒治療前后肺功能的比較 （±s）

注：［FEV1］第1秒用力呼氣容積；［FVC］用力肺活量。a示與CC基因型相比，P<0.05；b示與CT基因型相比，P<0.05。

基因型nFEV1(L)FVC(L)FEV1/FVC(%)治療前 治療后t值P值 治療前 治療后t值P值 治療前 治療后t值P值CC211.96±0.323.22±0.3811.623<0.0012.70±0.143.89±0.2519.032<0.00157±1281±97.332<0.001 CT532.05±0.313.23±0.3219.281<0.0012.74±0.143.93±0.3424.803<0.00152±1085±1024.010<0.001 TT991.96±0.333.28±0.3527.303<0.0012.75±0.154.09±0.48b26.512<0.00153±1087±10a23.921<0.001 F值1.2410.7631.3093.3841.1773.156 P值0.2920.4680.2730.0360.3110.045

2.5 MTHFR基因C667T多態(tài)性與支氣管哮喘患兒GC療效的相關(guān)性

比較3種基因型患兒的臨床療效，結(jié)果顯示臨床療效比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且TT基因型患兒控制良好比例顯著高于CC基因型（P<0.05）（表6）。以療效（控制良好=1，部分控制+未控制=0）為因變量，以基因型為自變量進行l(wèi)ogistic回歸分析，其中基因型按CC+CT、TT進行二分類，結(jié)果顯示GC對TT基因型患兒治療效果良好是CC/CT基因型患兒的2.111倍，見表7。

表6 不同基因型的臨床療效比較 ［例（%）］

表7 GC療效的logistic回歸分析

3 討論

近年來，隨著對兒童支氣管哮喘發(fā)病機制的不斷研究和認識的加深，多數(shù)學(xué)者認為其發(fā)病機制與多基因遺傳和環(huán)境因素的共同作用相關(guān)，尤其是遺傳因素是其治療療效差異的重要因素［12-13］。如已有研究表明，IL‐7 rs766736182、IL‐4 C33T位點多態(tài)性與哮喘易感性相關(guān)，且是兒童哮喘發(fā)生的獨立風(fēng)險因子［14-15］，因此進一步探討基因多態(tài)性與支氣管哮喘易感性之間的關(guān)系，對兒童支氣管哮喘的預(yù)防和治療工作具有重要的意義。MTHFR作為一種轉(zhuǎn)化還原酶，在甲硫氨酸-葉酸代謝過程中發(fā)揮重要作用。正常情況下，MTHFR一方面維持體內(nèi)血漿同型半胱氨酸的正常水平，另一方面還介導(dǎo)體內(nèi)嘧啶、嘌呤的合成及DNA、RNA和蛋白質(zhì)的甲基化修飾代謝過程；而MTHFR基因C677T突變后，酶活性及熱穩(wěn)定性改變，從而導(dǎo)致同型半胱氨酸水平升高，體內(nèi)生物合成、代謝途徑受阻，進而引發(fā)惡性腫瘤、心腦血管疾病及新生兒先天異常等一系列的疾病［16-17］。目前臨床對于MTHFR基因多態(tài)性的研究主要集中在C677T位點變異，該位點導(dǎo)致氨基酸序列中的丙氨酸被纈氨酸取代，從而引起不同基因型下的MTHFR酶活性差異［18-19］。研究發(fā)現(xiàn)MTHFRC677T位點TT基因型相對于CC基因型酶活性下降約60%~70%［20］，提示這可能是MTHFRC677T不同基因型致病性存在差異的原因。國內(nèi)外研究表明MTHFRC677T位點TT基因型較CC、CT基因型在高同型半胱氨酸血癥上具有更高的致病性，是多種心腦血管疾病發(fā)生的獨立危險因素［21-22］。目前關(guān)于MTHFR與呼吸系統(tǒng)疾病的相關(guān)性研究較少，少數(shù)研究報道了MTHFRC677T多態(tài)性與兒童支氣管哮喘的相關(guān)性，如國內(nèi)學(xué)者陳文舉等［23］分析了臺州地區(qū)哮喘兒童和正常兒童MTHFRC677T的多態(tài)性分布，結(jié)果顯示哮喘兒童與正常兒童的MTHFRC677T基因型及等位基因頻率分布均存在明顯差異，哮喘組中TT基因型頻率顯著升高，且T等位基因是哮喘發(fā)生的危險因素。而該基因多態(tài)性在河南漢族兒童中是否也存在相似的分布，對兒童哮喘的影響如何目前尚無報道。因此，本研究探討了河南漢族兒童哮喘與MTHFRC677T的多態(tài)性之間的關(guān)系，結(jié)果顯示與對照組相比，觀察組TT基因型分布頻率顯著高于對照組，T等位基因頻率也明顯升高，TT/CT相對于CC基因型的發(fā)病風(fēng)險為6.615倍，T等位基因相對于C等位基因的發(fā)病風(fēng)險為7.055倍，提示TT/CT基因型或攜帶T等位基因是支氣管哮喘易感性的獨立危險因素，與現(xiàn)有其他地區(qū)研究結(jié)果基本一致。

另外，彭昊等［24］研究表明，CHI3L1基因多態(tài)性可能與萍鄉(xiāng)地區(qū)哮喘患者易感性和GC療效有關(guān)，提示基因多態(tài)性不僅在一定程度上影響支氣管哮喘的易感性，還可能參與哮喘的進展和GC治療過程。近年來，已有研究報道了部分基因多態(tài)性與GC療效的相關(guān)性，如熊曉琦等［25］發(fā)現(xiàn)eotaxin‐3基因多態(tài)性除了與支氣管哮喘的發(fā)病有關(guān)，其+2497位點多態(tài)性還在一定程度上影響GC的療效，與CC和CT基因型相比，TT基因型對GC的治療更敏感，其肺功能和臨床癥狀改善效果更顯著；Mohamed等［26］的研究表明哮喘患者FokI基因多態(tài)性與GC耐藥性之間存在關(guān)聯(lián)，攜帶T等位基因的哮喘患者對GC的耐藥性更強［27］。多數(shù)研究指出其主要原因是哮喘的發(fā)生及病情進展往往伴隨著血清IgE、TNF‐α、IL‐8、IL‐17、LTB4等多種炎癥因子水平的改變和肺功能的減弱［28-30］，而GC是目前臨床常用的高效抗炎和免疫抑制藥物，主要通過改變T淋巴細胞活性和抑制IgE、IL‐8、LTB4等相關(guān)炎癥因子的分泌，從而減輕氣道慢性炎癥反應(yīng)，改善肺功能和哮喘臨床癥狀。因此，探討基因多態(tài)性與GC治療兒童哮喘療效的關(guān)系對于臨床用藥具有重要的指導(dǎo)意義。而以上研究已經(jīng)證實MTHFRC677T多態(tài)性和兒童支氣管哮喘的發(fā)生密切相關(guān)，其是否與GC治療療效有一定的相關(guān)性目前幾乎沒有相關(guān)報道，尚需求證。因此，為了探討MTHFRC677T不同基因型與哮喘治療療效之間的關(guān)系，本研究檢測了哮喘患兒GC治療前后血清IgE、IL‐8、LTB4水平和肺功能指標(biāo)FEV1、FVC、FEV1/FVC%的變化，并根據(jù)患兒臨床癥狀將患兒分為療效良好和療效一般組，結(jié)果顯示TT基因型療效良好患兒比例顯著高于CC基因型，治療后TT基因型患兒IL‐8和LTB4水平顯著低于CC基因型，LTB4水平明顯低于CT基因型；在肺功能上，治療后TT基因型患兒FVC明顯高于CT基因型，F(xiàn)EV1/FVC%顯著高于CC基因型；回歸分析結(jié)果顯示GC對TT基因型患兒治療效果良好是CT/CC基因型患兒的2.111倍，提示MTHFRC677T基因型多態(tài)性與GC療效存在相關(guān)性，TT基因型患兒可能具有更高的GC敏感性。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，MTHFRC677T基因多態(tài)性與兒童支氣管哮喘易感性及GC療效相關(guān)，攜帶T等位基因是兒童哮喘發(fā)生的獨立危險因素，TT基因型對GC療效具有更高的敏感性。該結(jié)論為臨床兒童哮喘的預(yù)防和治療提供了新思路，比如通過檢測兒童基因多態(tài)性預(yù)測哮喘發(fā)病率、針對不同基因型哮喘患兒采取針對性的個性化治療策略等，對臨床具有一定的指導(dǎo)意義，但本研究局限于單一地區(qū)且是小樣本研究，其基因多態(tài)性檢測是否適用于所有支氣管哮喘患兒，還需后續(xù)納入多地區(qū)行大樣本進一步研究。