反復凍融法對枸杞多糖溶出率的研究

溫梓辰，榮 雪，郭乃菲，陳點點，王慧妍，胡 丹，劉廣斌

(遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連 116600)

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反復凍融法對枸杞多糖溶出率的研究

溫梓辰，榮 雪，郭乃菲*，陳點點，王慧妍，胡 丹，劉廣斌

(遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連 116600)

[目的] 探究反復凍融法對枸杞多糖溶出率的影響。[方法]通過對解凍溫度、凍結時間、凍融次數、凍結溫度進行單因素試驗及正交試驗，驗證反復凍融法對枸杞多糖的提取效果影響。[結果] 當溫度低于45 ℃時，枸杞多糖的溶出率隨溫度的升高而升高，當溫度高于45 ℃時，枸杞多糖的溶出率卻降低；隨著凍融次數的增多，枸杞多糖的溶出率逐漸增大，但超過3次以后溶出率提升并不明顯；隨著凍結時間的增長，枸杞多糖的溶出率逐漸增大，當凍結時間超過3 h后，枸杞多糖溶出率趨于平穩，無明顯變化；隨著凍結溫度的降低，枸杞多糖的融出率逐漸增大，當凍結溫度低于-24 ℃后，枸杞多糖融出率趨于平穩，無明顯變化。[結論] 反復凍融法提取枸杞多糖的最佳工藝組合為：解凍溫度45 ℃，凍融次數4次，凍結時間3 h，凍結溫度-28 ℃。

枸杞多糖；反復凍融；溶出率；提取

枸杞既是傳統名貴中藥材，又是一種營養滋補品，市場上多以干品的形式進行交易，枸杞多糖可以改善老年人易疲勞、食欲不振和視力模糊等癥狀[1-2]，并具有降血脂、降血糖[3-4]、抗脂肪肝、抗衰老、抗腫瘤等作用[5-6]，但是，純品提取繁雜，價格昂貴。枸杞多糖粗品較純品相比，提取簡便，方便實驗探究。反復凍融法是利用凍結—解凍過程中枸杞細胞內部的冰晶體對細胞壁的機械作用而使其破裂的一種物理方法[7-8]，該法實驗操作簡單、環保，有利于保護多糖結構，提高多糖的生物利用率[9]。反復凍融所需條件在現代工業生產中比較容易獲得，為探究新的枸杞多糖提取方式，該文對反復凍融法與枸杞多糖溶出率之間的關系進行探討。

1　材料與方法

1.1材料與設備枸杞子，葡萄糖(標準品)，苯酚(分析純)，硫酸(分析純)，石油醚(分析純)，電子天平，紫外-可見分光光度計(UVmini-1240)，水浴鍋，冰箱。

1.2方法

1.2.1樣品處理。取枸杞子干品0.1 g，置于小瓷杯中，加水1 mL，溶脹20 min后，置于冰箱冷凍室冷凍，一段時間后取出，放入水浴鍋中解凍20 min，將溶脹的枸杞與溶液一并倒入250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL石油醚在48 ℃水浴的情況下回流1 h，過濾，于分液漏斗中分液，棄去有機層，剩余溶液與枸杞一并倒入250 mL圓底燒瓶中，加水150 mL，98 ℃水浴回流2 h，靜置冷卻后取1 mL溶液滴入250 mL容量瓶中，定容[10-11]。

1.2.2多糖含量測定。使用苯酚—硫酸法測定多糖[12]。

1.2.2.1標準曲線的繪制。精密稱取0.025 g葡萄糖標準品，置于250 mL量瓶中，定容至刻線，搖勻，作為葡萄糖標準品溶液(0.1 mg/mL)待用。準確吸取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于試管中，各加入蒸餾水，使其體積為2.0 mL，再加入6%苯酚1.0 mL，并迅速滴加濃硫酸5.0 mL，充分振蕩搖勻之后靜置15 min后，40 ℃水浴15 min。另外以蒸餾水2.0 mL，加苯酚和濃硫酸同上述操作做空白對照，于波長490 nm 處測吸光度值，得標準曲線。

1.2.2.2可溶性多糖溶出率的測定。 按“1.2.1”工藝處理樣品后，經顯色，在490 nm下測定吸光值，可計算可溶性多糖的溶出率。

可溶性多糖溶出率=[可溶性多糖質量(g)×稀釋倍數]/樣品質量(g)×100%

={[(A+0.064 6)×51 250]/(1.298 3×106×M)}×100%

式中：A為吸光度，M為樣品質量。

2　結果與分析

2.1葡萄糖標準曲線試驗測得葡萄糖標準曲線(圖1)。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1　Standard curve of glucose solution

2.2解凍溫度對枸杞多糖溶出率的影響共設5種解凍溫度處理，分別為30、45、60、75、90 ℃，在凍結時間1 h、凍結溫度-20 ℃，凍融1次的情況下實驗，測得枸杞多糖溶出率，結果見圖2。由圖2可知，解凍溫度對枸杞多糖的溶出率影響較為顯著。當溫度低于45 ℃時，枸杞多糖的溶出率隨溫度的升高而升高，當溫度高于45 ℃時，枸杞多糖的溶出率卻降低了。分析認為過高溫度易使枸杞多糖降解，而溫度不夠又會導致細胞壁破裂不充分，可溶性多糖溶出率降低[13]。

圖2　解凍溫度對枸杞多糖溶出率的影響Fig.2　Effect of thawing temperature on dissolving rate of Goji Berry polysaccharide

2.3凍融次數對枸杞多糖溶出率的影響共設5種凍融次數處理，分別為1、2、3、4、5次，在凍結時間1 h，凍結溫度-20 ℃，解凍溫度30 ℃的情況下實驗，測得枸杞多糖溶出率，結果見圖3。由圖3可知，隨著凍融次數的增多，枸杞多糖的溶出率逐漸增大，但超過3次以后溶出率提升并不明顯，分析認為，枸杞細胞結構經過3次凍融后基本被破壞，故對溶出率無明顯影響。

圖3　凍融次數對枸杞多糖溶出率的影響Fig.3　Effects of freezing-thawing times on dissolving rate of Goji Berry polysaccharide

2.4凍結時間對枸杞多糖溶出率的影響共設6種凍結時間處理，分別為1、2、3、4、5、6 h，在凍結溫度-20 ℃，解凍溫度30 ℃，凍融1次的情況下實驗，測得枸杞多糖溶出率，結果如圖4。由圖4可知，隨著凍結時間的增長，枸杞多糖的溶出率逐漸增大。當凍結時間超過3 h后，枸杞多糖溶出率趨于平穩，無明顯變化。分析認為，凍結3 h以上后，細胞內冰晶增長趨于飽和[14]，故對枸杞多糖溶出率無明顯影響。

圖4　凍結時間對枸杞多糖溶出率的影響Fig.4　Effect of freezing time on dissolving rate of Goji Berry polysaccharide

2.5凍結溫度對枸杞多糖溶出率的影響共設6種凍結溫度處理，分別為-20、-22、-24、-26、-28、-30 ℃，在凍結時間1 h，解凍溫度30 ℃，凍融1次的情況下實驗，測得枸杞多糖溶出率，結果如圖5。由圖5可知，隨著凍結溫度的降低，枸杞多糖的融出率逐漸增大。當凍結溫度低于-24 ℃后，枸杞多糖融出率趨于平穩，無明顯變化。分析認為，凍結溫度低于-24 ℃后，冰晶形成在細胞內部的比值達到最大[15]，無法對細胞壁的破壞做更多貢獻，故枸杞多糖融出率趨于平穩。

圖5　凍結溫度對枸杞多糖溶出率的影響Fig.5　Effects of freezing temperature on dissolving rate of Goji Berry polysaccharide

2.6正交實驗為選擇反復凍融法對枸杞多糖最佳溶出工藝條件，設計以解凍溫度、凍融次數、凍結時間、凍結溫度為考察因素，以枸杞多糖的溶出率為考察目標的L9(34)正交試驗，因素水平見表1。經過試驗，結果見表2。

以表3的方差分析為依據，選取凍結時間作為誤差估計項，研究結果表明，解凍溫度對枸杞多糖融出率有顯著影響。由表2可知，各因素對枸杞多糖融出率的影響是不同的，4個因素對枸杞多糖融出率的影響大小順序依次為：A>D>C>B。經過極差分析發現，反復凍融法提取枸杞多糖的最佳工藝組合為A2B3C2D3，即：解凍溫度45 ℃，凍融次數4次，凍結時間3 h，凍結溫度-28 ℃時，枸杞多糖融出率較高，在該工藝下做驗證試驗，得到3組數據：15.653%、15.644%、15.655%，驗證的平均值為15.651%。

表1　正交實驗因素水平

表2　正交試驗結果

表3　方差分析

3　結論

(1)各因素對枸杞多糖溶出率的影響順序為：解凍溫度>凍結溫度>凍結時間>凍融次數。

(2)分析認為，解凍溫度直接影響枸杞多糖的結構完整性，故解凍溫度為主要影響因素。凍結溫度雖然不會破壞枸杞多糖的結構，但直接影響冰晶的大小；凍結時間決定冰晶的數量，但低溫凍結生成的小冰晶對細胞壁破壞貢獻低，數量不足以彌補大小帶來的差距；凍融次數雖然越多越好，但多次凍融耗費時間，貢獻小，得不償失。

(3)反復凍融法提取枸杞多糖的最佳工藝組合是：解凍溫度45 ℃，凍融次數4次，凍結時間3 h，凍結溫度-28 ℃，在該條件下，枸杞多糖融出率可達到15.651%。

[1] 黃秋婷，陳遠鋒.枸杞多糖的研究及其進展[J].食品研究與開發，2006，27(3)：172-175.

[2] 劉錫建，肖穩發，曹儉，等.枸杞多糖的研究進展[J].上海工程技術大學學報，2008，22(4)：299-302.

[3] 李長江，張英鋒，高大威.枸杞多糖分離純化及降血糖效果的研究[J].燕山大學學報，2014，38(6)：557-560.

[4] 李朝暉，馬曉鸝，吳萬征.枸杞多糖降血糖作用的細胞實驗研究[J].中藥材，2012，35(1)：124-127.

[5] 南亞昀，雍學芳，劉瑛，等.枸杞多糖藥理學研究進展[J].天津中醫藥，2014，31(12)：763-765.

[6] 謝明勇，聶少平.天然產物活性多糖結構與功能研究進展[J].中國食品學報，2010，10(2)：1-11.

[7] 龔濤，王曉輝，趙靚.枸杞多糖抗氧化作用的研究[J].生物技術，2010，20(1)：84-86

[8] 郭衛蕓，杜冰，袁根良，等.反復凍融法破壁啤酒廢酵母的研究[J].釀酒科技，2009，177(3)：103-105.

[9] 郭衛蕓，劉海英，楊公明，等.反復凍融法輔助提取油菜花粉多糖的研究[J].食品研究與開發，2013，34(13)：26-28，40.

[10] 汪興平，謝筆鈞，程超，等.反復凍融法在葛仙米破壁技術上的應用[J].食品科學，2005，26(3)：162-165.

[11] 尚喜雨.水提法·酶法提取鐵皮石斛多糖的比較研究[J].安徽農業科學，2010，38(18)：9787- 9788.

[12] 劉曉涵，陳永剛，林勵，等.蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測定枸杞子中多糖含量的比較[J].食品科技，2009，34(9)：270-272.

[13] 劉紅英，高瑞昌.食品化學[M].北京：中國計量出版社，2013：84-85.

[14] 張根生，韓冰.食品加工單元操作原理[M].北京：科學出版社，2013：220-221.

[15] 劉紅英.水產品加工與貯藏[M].2版.北京：化學工業出版社，2012：40-41.

Technique of Extracting Polysaccharides from Goji Berry by Repeated Freezing and Thawing Method

WEN Zi-chen ,RONG Xue, GUO Nai-fei*et al

(College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian, Liaoning 116600)

[Objective] To study the effects of repeated freezing and thawing method on rate of extracting polysaccharides from Goji Berry. [Methods] Single factor experiment and orthogonal test were carried out for thawing temperature, freezing time, freezing and thawing times, and freezing temperature, to verify the effects of repeated freezing and thawing method on rate of extracting polysaccharides from Goji Berry. [Results] When the temperature was lower than 45 ℃, the dissolving rate of polysaccharides increases with temperature rise; when the temperature is higher than 45 ℃, the dissolving rate of polysaccharides drops; with increase in freezing-thawing times, the increase of dissolving rate of polysaccharides is slight when the freezing time exceeds 3 h; with increase in the freezing time, the dissolving rate of polysaccharides gradually increases, but when the freezing time exceeds 3 h, the dissolving rate of polysaccharides tends to become steady; when the freezing temperature drops, the dissolving rate of polysaccharides gradually rises, but when the temperature is lower than -42 ℃, the dissolving rate of polysaccharides tends to become steady. [Conclusion] The optimal process combination of repeated freezing and thawing method for extracting polysaccharides from Goji Berry is as follows: 45 ℃ for thawing temperature, 4 for repeated times; 3 h for freezing time; -28 ℃ for freezing temperature.

Goji Berry polysaccharides; Repeated freezing and thawing method; Dissolving rate; Extraction

遼寧省2014省級大學生創新創業訓練項目(20141016-2000035)。

溫梓辰(1996- )，男，湖南長沙人，本科生，專業：藥學。*通訊作者，講師，博士，從事食品質量與安全研究。

2016-05-26

S 567.1+9

A

0517-6611(2016)19-111-03