亞臨界水提取靈芝酸性和中性三萜的工藝研究

朱忠敏

亞臨界水提取靈芝酸性和中性三萜的工藝研究

朱忠敏

（福建仙芝樓生物科技有限公司，國家食用菌加工技術研發分中心，藥用菌栽培與深加工國家地方聯合工程研究中心，福州 350002）

為優化亞臨界水提取靈芝酸性和中性三萜的工藝參數，采用正交試驗方法，考察提取溫度、壓力、時間對提取結果的影響，以HPLC法測定靈芝酸性和中性三萜含量。結果表明，亞臨界水提取靈芝三萜的優化條件為料液比1︰16，溫度180 ℃，壓力4 MPa，提取時間10 min。此條件下靈芝酸性三萜得率為1.132 mg/g，中性三萜得率為0.582 mg/g。結論：亞臨界水提取靈芝酸性和中性三萜，較超臨界CO2提取方法成本低，較傳統的乙醇回流方法提取時間明顯縮短，且不含有機溶劑，是一種于環境友好的產業化提取技術。

亞臨界水提取；靈芝酸性和中性三萜；HPLC檢測

靈芝（）為多孔菌科真菌，藥用始載于《神農本草經》，至今有兩千多年的歷史，是中華人民共和國藥典收載的法定中藥材，其主要藥用功能為“補氣安神，止咳平喘。用于心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘，虛勞短氣，不思飲食”[1]。現代藥理學研究證實，靈芝三萜是靈芝中的主要生物活性成分，具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、抗菌抗病毒等多種功效[2-7]。

靈芝三萜可分為酸性三萜（靈芝酸）和中性三萜兩大類，國內外研究多集中在靈芝酸性三萜，對于中性三萜研究較少，而實際上，中性三萜比酸性三萜具有更高的生物活性[8-9]，不僅能抑制增殖期的腫瘤細胞，而且能誘導休眠期腫瘤細胞的凋亡[10]。由于三萜化合物難溶于水，通常采用乙醇回流法、高壓超臨界CO2提取法及以乙醇為夾帶劑的超臨界CO2提取法提取靈芝三萜[11-15]。目前雖有報道亞臨界水提取靈芝酸研究[16]，但關注亞臨界水提取靈芝三萜的較少，我們采用正交試驗方案，探索亞臨界水同步提取靈芝酸性和中性三萜的優化工藝，以期為靈芝三萜的產業化生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

靈芝顆粒（赤靈芝119，由福建仙芝樓生物科技有限公司提供，經福建農林大學菌物研究中心菌種鑒定）；靈芝三萜的對照品有靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C2、靈芝酸F、靈芝酸G、靈芝酸H、赤芝酸A、靈芝烯酸D和靈芝酮三醇等10個，由中國醫學科學院藥物研究所提供；甲醇（色譜級，廣東光華）；乙腈（色譜級，廣東光華）；冰醋酸（色譜級，廣東光華）；超純水（實驗室自制，GWA-UN，北京普析通用）；乙醇（分析級，廣東光華）等。

1.2 儀器設備

亞臨界水提取裝置（500 mL，中國林業科學院林產化學工業研究所定制設備）；液相色譜儀（LC-20A，日本島津）；超聲波清洗器（KQ-500，昆山超聲儀器）；旋轉蒸發儀（W2-100SP，上海申科）；色譜柱（LP-C18，4.6 mm′250 mm，5 μm，Welch）。

1.3 試驗方法

1.3.1 靈芝原料的預處理

將赤靈芝原料粉粹、過篩，取40～60目細顆粒混合均勻，稱取25.0 g共12份，其中9份按正交試驗方案做亞臨界水的提取實驗，3份做最佳方案的驗證實驗；另外稱取5.0 g二份，用于乙醇提取對比實驗。提取獲得的提取液，經過濾、濃縮、干燥，得提取物浸膏，作HPLC檢測用。

1.3.2 亞臨界水提取靈芝三萜的正交實驗

9份25.0 g的靈芝原料，每份加水定容至400 mL（料液比1︰16），采用3因素3水平的L9(33)正交試驗表進行試驗。根據亞臨界水提取的特點，將主要參數溫度（℃）、壓力（MPa）和時間（min）設置為3因素。由于靈芝的植物纖維含量高，在亞臨界水提取溫度超過250 ℃時，會出現焦味碳化現象，因此將溫度因素的3個水平設置為不超過250 ℃，同時參照亞臨界水提取特性，分別設置壓力和時間的3水平（表1），以提取率（mg/g）為指標。

表1 亞臨界水提取靈芝三萜因素和水平設計表

1.3.3 乙醇提取靈芝三萜的對比實驗

二份5.0 g的靈芝顆粒原料，加入100 mL 95%乙醇（料液比1︰20），回流提取2 h，提取液經過濾、減壓濃縮得提取物浸膏，做HPL檢測用。

1.3.4 靈芝三萜檢測

將1.3.1中得到的提取物浸膏，用95%乙醇超聲溶解，置于4 ℃冰箱冷藏過夜；第二天，取上清液濃縮，定容后進行HPLC檢測。由于酸性三萜和中性三萜的極性和最大紫外吸收波長有差異，采用不同HPLC檢測方法，分別測定提取物中酸性三萜含量[9]和中性三萜含量[10-11]。方法如下：

（1）酸性三萜（靈芝酸）的HPLC檢測采用HPLC測定，用一測多評法計算[17-19]。HPLC的條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相（4.6 mm′250 mm，5 μm）；以乙腈為流動相A，0.04%甲酸水為流動相B，按表2設置進行梯度洗脫；檢測波長257 nm，柱溫為30 ℃，流速1.0 mL/min。理論塔板數按靈芝酸A峰計算應不低于10 000。

表2 流動相運行梯度條件

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測定，以一測多評法計算。對照品和供試品液相譜圖見圖1和圖2。

根據所得的各對照品和供試品的峰面積，分別計算被測定供試品溶液中各種靈芝酸的含量，酸性三萜的含量以9種三萜的含量之和計。供試品中各靈芝酸含量以提取率W計，數值以mg/g表示，按公式（E.1）計算。

式中：—樣品中各靈芝酸的提取率（mg/g）；—樣品中各靈芝酸的峰面積；—對照品溶液靈芝酸A峰面積；—對照品溶液中靈芝酸A濃度（mg/mL）；—相對校正因子；—供試品溶液體積（mL）；—用于制備供試品溶液的靈芝原料重量（g）。

（2）中性三萜（靈芝醇、酮和醛等）的HPLC檢測。目前，靈芝中性三萜的標準品稀少而昂貴，峰面積歸一化法進行計算。我們參照文獻[11]的

表3 相對校正因子表F

HPLC色譜條件進行分析，用峰面積歸一化法進行計算。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相（4.6 mm′250 mm，5 μm）；以甲醇為流動相A，0.5%乙酸水為流動相B，按表4設置進行梯度洗脫，檢測波長243 nm，柱溫為30 ℃，流速1.0 mL/min。理論塔板數按靈芝酮三醇峰計算應不低于10 000。

表4 流動相運行梯度條件

測定法：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，以峰面積歸一化法計算。對照品和供試品液相譜圖見圖3和圖4。

根據所得對照品和供試品的峰面積，分別計算出被測定供試品溶液中所有中性三萜類物質的含量，含量以提取率W計，數值以mg/g表示，按公式（E.2）計算。

式中：—樣品內中性三萜類化合物的提取率（mg/g）；A—樣品內中性三萜各峰面積總和；A—對照品溶液靈芝酮三醇峰面積；C—對照品溶液靈芝酮三醇濃度（mg/mL）；—供試校品溶液體積（mL）；—用于制備供試品溶液的靈芝原料重量（g）。

2 結果與分析

2.1 亞臨界水提取靈芝酸性三萜正交試驗結果

由表5可以看出，試驗結果以A2B3C1組合方案的提取率最高，達1.038 mg/g。考慮到3因素3水平的組合共有81個，可能有其他組合方案提取率更高，按照“水平—提取率”的關系做進一步計算分析[20]。首先將A因素第1、2、3水平的提取率相加，分別記為K1a(M1+M2+M3)=0.783、K2a(M4+ M5+M6)=0.993、K3a(M7+M8+M9)=0.190。以此類推，可得到B因素3個水平的提取率加和K1b(M1+ M4+M7)=0.604、K2b(M4+M5+M6)=0.688、K3b (M3+M6+M9)=0.674，C因素3個水平的提取率加和K1c(M1+M4+M7) =0.686、K2c(M4+M5+M6)=0.648、K3c(M3+M5+M7)=0.632。然后，取各因素的水平提取率加和最大值K2a、K2b、K1c，組合成A2B2C1為最佳方案。這個最佳方案的提取率會不會比組合A2B3C1更好呢？將在下面作進一步實驗驗證。

1. 靈芝酸C2；2. 靈芝酸G；3. 靈芝酸B；4. 靈芝酸A；5. 靈芝酸H；6. 赤芝酸A；7. 靈芝烯酸D；8. 靈芝酸C；9. 靈芝酸F。

圖2 亞臨界水提取靈芝酸HPLC譜圖

圖3 靈芝酮三醇對照品HPLC譜圖

圖4 亞臨界水提取靈芝中性三萜HPLC譜圖

另一方面，計算各因素的極差R，即將該因素的K的最大值減去最小值。極差R越大的因素對提取率的影響越大，結果Ra的極差最大，得出溫度是影響提取率的最重要因素，其次是壓力，最小是時間。這與亞臨界水的提取時間短、提取效率高，溫度因素影響最顯著的特征相吻合[20-25]。

表5 亞臨界水提取靈芝酸性三萜的L9(33)正交試驗結果

2.2 亞臨界水提取靈芝中性三萜正交試驗結果

對表6中的實驗數據，采用表5的“水平—提取率”計算方法，獲得各因素的不同水平提取率最大加和K2a=0.478、K2b=0.313、K3c=0.307，組合成A2B2C1（溫度180 ℃，壓力4 MPa，時間10 min）為最佳方案。這與提取酸性三萜的最佳方案一致。同時，極差R也是Ra最大，即溫度對提取率影響最大，以下依次為壓力和時間。

2.3 最佳方案的驗證實驗

按照上述得到最佳方案A2B2C1：料液比1︰16，溫度180 ℃，壓力4 MPa，時間10 min，重復試驗3次，試驗結果為靈芝酸得率1.132 mg/g，中性三萜化合物得率0.582 mg/g。

2.4 亞臨界水提取與傳統乙醇回流提取的比較

采用優化的亞臨界水提取靈芝三萜方法與傳統的乙醇回流提取法進行比較，以亞臨界水提取的最佳設計方案（料液比1︰16，在180 ℃、4 MPa下提取10 min）得到的靈芝酸提取率為1.132 mg/g、中性三萜提取率為0.582 mg/g；而乙醇回流提取（料液比1︰20，80 ℃、常壓下提取120 min）的提取率是靈芝酸1.185 mg/g，靈芝中性三萜0.606 mg/g。可見，亞臨界水提取靈芝三萜的提取率基本與乙醇回流提取的相近，但提取時間大大縮短，僅為乙醇提取法的1/12，大幅降低了工業生產時間和能耗；且乙醇回流法乙醇成本較高，還潛存有機殘留風險。

表6 亞臨界水提取靈芝中性三萜的L9(33)正交試驗結果

3 結 論

亞臨界水提取技術由于其無溶劑殘留、快速和節能等優點，現已在食品工業、中藥和天然產物活性成分的提取[21-22, 24, 26-28]等方面獲得了廣泛的應用。本文通過正交試驗，得到亞臨界水提取靈芝酸性和中性三萜的優化工藝條件，其提取率與傳統的乙醇回流法相近，但比后者更具綠色環保、省時節能、效率高等優點。與高壓超臨界CO2提取法或以乙醇為夾帶劑的超臨界CO2提取法相比，成本低且無有機溶劑殘留，更適合應用于工業化生產，為靈芝三萜的提取應用提供一種新途徑。

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Study on acidic and neutral triterpenoids from Ganoderma lucidum by subcritical water extraction

Zhu Zhongmin

(Fujian Xianzhilou Biological Science ＆ Technology Co., Ltd; National R＆D Center For Edible Fungi Processing; Fujian Engineering Research Center for Medicinal Fungi; National and Local Joint Engineering Research Center for Cultivation and Deep Processing of Medicinal Fungi; Fuzhou, Fujian 350002, China)

In order to optimize the process parameters of acidic and neutral triterpenoids fromby subcritical water extraction (SWE).The effects of extraction temperature, pressure and time on the results were investigated by orthogonal test. The acidic and neutral triterpenoids ofwere determined by HPLC.The results showed thatthe optimum conditions of SWE extraction were: the solid-liquid ratio 1/16, tempereture 180 ℃,pressure 4 MPa, extraction time 10min. Under these conditions, the yield of acidic and neutral triterpenoids were 1.132 mg/g and 0.582 mg/g respectively. As an industrial extraction technology, the SWE is worthy for promotion, for its environmentally friendly, and compared with the supercritical CO2extraction, the SWE could reduce the costs. Compared with the traditional ethanol reflux method, the SWE could shorten the extraction time, and containing no organic solution.

subcritical water extraction; acidic and neutral triterpenoids from;HPLC

S567.3+1

B

2095-0934（2021）04-334-06

福州市市級科技計劃項目—“一帶一路”及對外科技合作項目（2019－S－107）