血漿環狀RNA_0002867對HBV相關性肝癌診斷價值的初步研究

何婭娣?吳振權?侯國良

【摘要】目的 探討血漿環狀RNA_0002867（circ_0002867）對HBV相關性肝細胞癌（肝癌）的診斷價值。方法 分析已發表的測序結果，篩選在肝癌患者的組織和血漿中同時高表達的環狀RNA，通過微滴數字PCR（ddPCR）檢測35例HBV相關性肝癌患者（肝癌組）及30例HBV相關性肝硬化患者（肝硬化組）血漿circ_0002867表達水平，電化學發光法檢測2組患者的血清甲胎蛋白水平，應用受試者工作特征（ROC）曲線分析血漿circ_0002867、血清甲胎蛋白及兩者聯合對HBV相關性肝癌的診斷價值。結果 在肝癌患者的組織和血漿中同時高表達的環狀RNA中取交集篩選出circ_0002867行進一步驗證。肝癌組血漿circ_0002867表達水平為（29.63±11.56）copies/ml，高于肝硬化組的（19.15±11.57）copies/ml（P < 0.001）;血漿circ_0002867、血清甲胎蛋白及兩者聯合診斷HBV相關性肝癌的ROC曲線下面積分別為0.725（95% CI 0.600～0.828）、0.670 （95% CI 0.542～0.781）、0.810（95%CI 0.693～0.896），血漿circ_0002867和血清甲胎蛋白兩者聯合提高了血清甲胎蛋白診斷HBV相關性肝癌的效能（P < 0.05）。結論 血漿circ_0002867聯合血清甲胎蛋白對診斷HBV相關性肝癌具有較好的臨床價值。

【關鍵詞】乙型肝炎病毒;肝細胞癌;診斷;血漿;甲胎蛋白;環狀核糖核酸

Plasma circular RNA_0002867 as a diagnostic biomarker for hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma He Yadi， Wu Zhenquan， Hou Guoliang. Health Management Center， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， He Yadi， E-mail： heyadi2015@ 126. com

【Abstract】Objective To investigate the diagnostic value of plasma circular RNA_0002867 （circ_0002867） for hepatitis B virus （HBV）-related hepatocellular carcinoma （HCC）. Methods The published sequencing results were analyzed to screen the high expression of circular RNAs in both tissues and plasma of HCC patients. The expression levels of plasma circ_0002867 were detected by digital droplet polymerase chain reaction （ddPCR） in 35 patients with HBV-related HCC and 30 patients with HBV-related liver cirrhosis. The serum alpha-fetoprotein （AFP） levels were determined by electrochemiluminescence in two groups. The receiver operating characteristic （ROC） curve was delineated to analyze diagnostic values of plasma circ_0002867， serum AFP and these two combined for HCC. Results The circ_0002867， which was highly expressed in both tissues and plasma of HCC patients， was screened for subsequent validation. The expression level of plasma circ_0002867 in the HBV-related liver cirrhosis group was significantly lower than that in the HBV-related HCC group （（19.15±11.57） copies/ml vs. （29.63±11.56） copies/ml; P < 0.001））. The area under ROC for plasma circ_0002867， serum AFP， and these two combined was 0.725 （95% CI 0.600-0.828）， 0.670 （95% CI 0.542-0.781） and 0.810 （95% CI 0.693-0.896）， respectively. The combination of serum AFP and plasma circ_0002867 significantly improved the diagnostic accuracy of serum AFP for HBV-related HCC （P < 0.05）. Conclusion Plasma circ_0002867 combined with serum AFP is a potential diagnostic biomarker for HBV-related HCC in clinical practice.

【Key words】Hepatitis B virus;Hepatocellular carcinoma; Diagnosis;Plasma;Alpha-fetoprotein;

Circular RNA

肝細胞癌（肝癌）主要由HBV感染引起，是我國第2常見的消化系統實體瘤，也是惡性腫瘤死亡的第2大原因[1]。肝癌的高病死率與其早期缺乏臨床癥狀、在發現時大部分已處于晚期密切相關[2]。目前臨床上常用的血清甲胎蛋白診斷肝癌的靈敏度和特異度分別為39% ～ 64%和76% ～ 91%，其效能仍有待提高[3]。一項多中心的回顧性研究表明，Cmi（7個血清微RNA的組合）診斷肝癌的靈敏度和特異度分別為70% ～ 86%和80% ～ 91%[4]。環狀RNA （circRNA）與微RNA同屬于非編碼RNA。與微RNA相比，circRNA具有閉合環狀結構，可耐受核酸外切酶，穩定性更高。有研究顯示，血漿組合circRNA （circ_0000976，circ_0007750和circ_0139897）對直徑≤3 cm的肝癌具有較高的診斷效能，優于血清甲胎蛋白[5]。本研究分析已發表circRNA測序結果，采用微滴數字PCR （ddPCR）檢測技術，探索血漿circRNA對診斷HBV相關性肝癌的價值，現報告如下。

對象與方法

一、研究對象及資料收集

選擇2019年1月至2020年12月佛山市第一人民醫院收治的35例HBV相關性肝癌患者為肝癌組;同期收集30例HBV相關性肝硬化患者為肝硬化組。納入標準：①年齡18 ～ 80歲;②有慢性乙型肝炎病史;③經肝病理活組織檢查（活檢）確診為肝癌或肝硬化;④臨床資料完整，在治療前采集外周血。排除標準：外周血RNA提取總量不足。所有受試者均簽署知情同意書，并經佛山市第一人民醫院醫學倫理委員會批準。分別記錄2組患者的性別、年齡、身高和體質量，計算BMI。

二、血清甲胎蛋白檢測

于患者入院后治療前采用非抗凝干燥無菌真空管收集3～5 ml外周血，室溫下以1000轉/分離心5 min，取上清至EP管置-80℃保存;按照甲胎蛋白檢測試劑盒（電化學發光法，羅氏公司）說明書操作要求及步驟，采用羅氏E601全自動電化學發光免疫分析儀檢測血清甲胎蛋白水平。

三、血漿肝癌特異性circRNA篩選

分析5對肝癌組織及鄰近正常肝組織的circRNA表達譜，共得到191個高表達circRNA;10例HBV相關性肝癌患者及5例HBV相關肝硬化患者的血漿circRNA表達譜，共得到124個高表達circRNA[6-7]。circBase數據庫用于注釋差異circRNA。通過取交集，篩選出血漿肝癌特異性circRNA。

四、血漿采集及RNA提取

于患者入院后治療前使用經乙二胺四乙酸二鈉處理的試管采集約8 ml外周血，采集后2 h內于4℃ 3000×g離心15 min獲取血漿，然后立即使用miRNeasy Mini試劑盒（Qiagen）提取血漿中總RNA，操作嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

五、逆轉錄模板DNA（cDNA）

應用逆轉錄試劑盒Perfect Real Time （TaKaRa），將提取的RNA逆轉錄為cDNA。按照說明書配置10 μl反應體系，包括2 μl 5倍體積稀釋的PrimeScript 緩沖液，0.5 μl PrimeScript 逆轉錄酶混合物Ⅰ，0.5 μl隨機6核苷酸引物（100 μmol/L），RNA和水配置至10 μl。反應程序：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。

六、dd PCR檢測

引物序列：circ_0002867正向為5-CCATG

CCACAGTCCGCAATG-3，反向為5-TCCAACTGC TCCACGACACA-3，產物長度為125 bp。ddPCR使用20 μl反應體系（2 μl cDNA，10 μl QX200 EvaGreen ddPCR Supermix，4 μmol/L上下游引物;

無酶水替代cDNA設置陰性對照）在QX200 ddPCR系統上進行。向反應體系中加入70 μl微滴生成油生成微滴，吸取40 μl微滴至96孔PCR板在T100TM PCR儀器進行擴增，反應條件：95℃

5 min;95℃ 30 s，64℃ 60 s，循環45次;4℃ 5 min，

90℃ 5 min穩定信號;4℃保存。采用微滴分析儀和QuantaSoft軟件分析檢測結果。

七、統計學處理

繪圖及統計分析使用SPSS 25.0和R 3.6.1。符合正態分布的計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗;非正態分布用M（Q25，Q75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。使用logisitic回歸分析（Enter法）納入血清甲胎蛋白和血漿circ_0002867兩個變量，建立回歸方程，繪制受試者工作特征（ROC） 曲線分析血清甲胎蛋白和血漿circ_0002867表達水平對HBV相關性肝癌的診斷效能;采用DeLong檢驗分析2條ROC曲線之間的差異。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、肝硬化組與肝癌組患者的一般資料

共納入65例患者，其中肝硬化組30例、肝癌組35例，組間年齡構成、性別構成、BMI和肝功能child-pugh分級比較差異均無統計學意義（P均> 0.05）。肝癌組血清甲胎蛋白水平高于肝硬化組（P < 0.05），見表1。

二、血漿肝癌特異性circRNA篩選結果

通過文獻[6]肝癌組織和鄰近正常肝組織的circRNA表達譜，以及文獻[7] HBV相關性肝癌患者及HBV相關肝硬化患者的血漿circRNA表達譜，取交集篩選出circ_0002867行進一步驗證，見圖1。其在肝癌組織及鄰近正常肝組織的差異倍數為3.804，錯誤發現率（FDR）為0.001;在HBV相關性肝硬化患者血漿的差異倍數為2.057，FDR < 0.001。

三、血漿circ_0002867、血清甲胎蛋白對HBV相關性肝癌的診斷效能

肝癌組血漿circ_0002867表達水平為（29.63

±11.56）copies/ml，高于肝硬化組的（19.15± 11.57）copies/ml（t = 3.585，P < 0.001），見圖2A。ROC曲線分析顯示血漿circ_00028677診斷HBV相關性肝癌的曲線下面積（AUC）為0.725（95% CI 0.600 ～ 0.828），當診斷臨界值為17.10 copies/ml時，靈敏度和特異度分別為85.7%和50.0%，其可作為血漿circ_00028677診斷HBV相關性肝癌的最佳臨界值，見圖2B。

血漿circ_0002867、血清甲胎蛋白及兩者聯合診斷HBV相關性肝癌 [Logit（P） = -2.910+0.003×甲胎蛋白+0.095×circ_0002867]的ROC AUC分別為0.725 （95% CI 0.600 ～ 0.828）、0.670 （95% CI 0.542 ～ 0.781）、0.810 （95% CI 0.693 ～ 0.896）。血漿circ_0002867和血清甲胎蛋白兩者聯合診斷提高了血清甲胎蛋白單一診斷HBV相關性肝癌的效能（Z = 2.483，P = 0.013），其他任2者比較差異均無統計學意義（P均> 0.05）。ROC曲線分析提示血漿circ_0002867與血清甲胎蛋白聯合診斷HBV相關性肝癌的靈敏度和特異度分別為65.7%和90.0%，而血清甲胎蛋白單獨診斷HBV相關性肝癌的靈敏度和特異度分別為60.0%和80.0%，聯合診斷提高了診斷的靈敏度及特異度。

討論

在中國，大多數肝癌患者都有乙型肝炎相關病史，造成炎癥和肝細胞再生持續存在，炎癥和肝硬化同時存在使得肝癌的早期診斷更加困難[8]。肝癌的預后與治療時機至關重要，早期肝癌可通過手術或介入的方式取得良好的療效，但由于肝癌早期缺乏特異的臨床癥狀，很多患者在確診時已處于晚期，嚴重影響其預后。目前血清甲胎蛋白是診斷和判斷肝癌預后的重要標志物之一，但其易受炎癥等指標的影響。因此，急需尋找新的生物標志物用于協助診斷肝癌。液體活檢通過檢測體液包括血液、尿液中的生物分子如RNA、DNA、蛋白等診斷疾病和預測患者預后，其與傳統組織活檢相比具有損傷小、取樣方便等優勢。

本研究中，我們通過分析已發表測序數據，探索血漿circRNA在HBV相關性肝癌中的診斷價值。首先，我們分別篩選肝癌組織和血漿中circRNA的差異表達譜，通過取交集的方式，尋找到肝癌特異性circRNA （circ_0002867），2項研究中的測序結果表明circ_0002867在肝癌患者的癌組織和血漿中同時高表達。血液樣本是臨床中最常用的樣本之一，收集和保存運輸方便，重復檢測可行性更強。本研究使用ddPCR檢測血漿circ_0002867表達水平，ddPCR為第3代PCR技術，不需要內參基因，可實現對檢測物質的絕對定量，對檢測微量物質較傳統的實時熒光定量PCR相比更具優勢[9]。研究顯示，肝癌組血漿circ_0002867表達水平高于肝硬化組，提示利用血漿circ_0002867診斷HBV相關性肝癌具有可行性。

血漿circ_0002867與血清甲胎蛋白兩者聯合診斷與血清甲胎蛋白單一診斷HBV相關性肝癌的ROC AUC分別為0.810和0.670。與血清甲胎蛋白相比，血漿circ_0002867與血清甲胎蛋白兩者聯合診斷提高了其診斷效能，尤其是提高了靈敏度和特異度。因此，兩者聯合可更好地診斷HBV相關性肝癌。值得注意的是，circ_0002867來源于HBV相關性肝癌的組織和血漿中circRNA差異表達譜，此研究結果是否適用于非HBV相關性肝癌，尚有待進一步研究。

綜上所述，circ_0002867聯合血清甲胎蛋白可提高血清甲胎蛋白的診斷效能。結合circRNA耐酶穩定和血液樣本易獲取的優點，血漿circ_0002867聯合血清甲胎蛋白診斷HBV相關性肝癌可能具有更高的臨床價值，值得進一步研究。

參? 考? 文? 獻

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（收稿日期：2021-06-01）

（本文編輯：林燕薇）