腦心舒口服液中10-羥基-2-癸烯酸、苯甲酸含量測定及質量評價

劉燦黃，何清彥，吳勝男，劉波，林新文，蔣桃

1.長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410208；2.湖南省藥品審評認證與不良反應監測中心，湖南 長沙 410013；3 湖南食品藥品職業學院，湖南 長沙 410208

腦心舒口服液是滋補鎮靜安神類中成藥，用于身體虛弱、心神不寧、失眠多夢、神經衰弱、頭痛眩暈等，尤其在頑固性神經衰弱方面療效顯著［1］。國家藥品監督管理局網站上可以查詢到101 條“腦心舒口服液”批準文號，腦心舒口服液是典型的“一品多家”中成藥品種。網上銷售價格0.5～3.0 元/支，價格相差近6 倍。腦心舒口服液由蜜環菌濃縮液和蜂王漿組成，其制法是取蜂蜜加熱煉制，濾過，放冷，與研磨好的蜂王漿混勻，再加入蜜環菌濃縮液，苯甲酸鈉及香精的乙醇液，混勻，調整總量，攪勻，濾過，即得。主要成分蜜環菌是天麻的共生菌，與天麻有相似的生物活性，有明顯的鎮靜安眠作用［2］；蜂王漿是集營養、食療及保健多位一體的天然物質，具有抑菌、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗腫瘤、調節免疫及護膚美容等多方面藥理作用。蜂王漿有效成分10-羥基-2-癸烯酸（10-HDA）是蜂王漿特有的脂肪酸，俗稱王漿酸，是蜂王漿的標志物［3］。

腦心舒口服液目前質量標準主要有國家藥品監督管理局國家藥品標準 WS3-B-3975-98-2002、WS-11356（ZD-1356）-2002-2012Z、國家藥品監督管理總局國家藥品標準 WS3-B-3975-98-2002-1、國家藥品監督管理局標準（試行）YBZ27332005。處方制法均一致，但各標準均不相同。大部分生產企業執行的是國家藥品監督管理局國家藥品標準WS3-B-3975-98-2002［4］，標準中含化學、薄層鑒別、相對密度、pH 值、裝量、微生物限度等檢查項，無含量測定項。本文就湖南省2020 年抽檢的流通環節全部執行WS3-B-3975-98-2002 標準的6 個廠家11 批腦心舒口服液進行質量分析，對其有效成分10-羥基-2-癸烯酸和防腐劑苯甲酸進行定量探索研究［5-10］，為其成藥整體質量評價和標準提升提供研究基礎，為該品種的質量監管提供技術支撐。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20AD 高效液相色譜儀，SPD-M20A檢測器，SIL-20A 自動進樣器，LC solution 色譜工作站，電子天平 METTLER TOLEDO XS205DU，新芝SB-800 DTD 超聲儀。

1.2 試藥

10-羥基-2-癸烯酸（批號：110812-201808，97.5%），苯甲酸（批號：100419-201703，99.9%），對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；試劑甲醇、磷酸均為分析純，水（超純水），乙腈（色譜純）。腦心舒口服液樣品信息如下，按標準檢驗均合格，結果見下表1。

表1 樣品信息及按標準檢測指標結果

2 方法與結果

2.1 色譜條件

CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）為流動相，流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃，波長207 nm 測定10-羥基-2-癸烯酸，230 nm 處測定苯甲酸，進樣量10 μL；分析時間40 min。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A.10-羥基-2-癸烯酸對照品（207 nm）；B.苯甲酸對照品（230 nm）；C.樣品（207 nm）；D.樣品（230 nm）

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取10-羥基-2-癸烯酸對照品適量，至棕色量瓶中，加甲醇制成濃度為10 μg/mL 的對照品溶液。精密稱取苯甲酸對照品適量，至棕色量瓶中，加甲醇制成濃度為50 μg/mL 的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品2 mL 置25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。取續濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系取混合對照品溶液2，5，10，15，20，25 μL 在上述色譜條件分別進樣，測定峰面積。以進樣量（μg）為橫坐標（X），相應對照品峰面積為縱坐標（Y），求得10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸的回歸方程分別為Y=1.16×106X+388.14（r=0.999 7）；Y=1.07×106X+4 743（r=0.999 1），結果表明，10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸進樣量分別在0.02～0.25 μg，0.10～1.25 μg 范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.4.2 重復性試驗取同一批號的腦心舒口服液樣品，按“2.3”項下方法制備6 份供試品溶液，在上述色譜條件下分別進樣，計算10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸含量的RSD 分別為1.4%，1.1%。結果表明，方法重復性良好。

2.4.3 精密度試驗取混合對照品溶液，在上述色譜條件下，重復進樣6 次，每次10 μL，計算10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸色譜峰面積的RSD 分別為0.7%，1.0%。結果表明，儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗取同一批號的腦心舒口服液樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，于0、4、8、12、16、20、24 h，在上述色譜條件下分別進樣，計算10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸色譜峰面積的RSD 別為1.3%，0.8%。結果表明，樣品溶液在24 h 內穩定。

2.4.5 回收率試驗取已知含量（10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸的含量分別為0.199 mg/mL，2.246 mg/mL）的腦心舒口服液6 份，每份精密量取1 mL，每份精密加入含10-羥基-2-癸烯酸對照品儲備液（濃度為0.1 mg/mL）1 mL 和苯甲酸對照品儲備液（濃度為0.5 mg/mL）4 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析測定，計算回收率。結果10-羥基-2-癸烯酸及苯甲酸的平均回收率分別為99.01%，100.13%，RSD 分別為1.2%，0.9%。

2.5 樣品含量測定

分別取腦心舒口服液按“2.3”項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μL，在上述色譜條件下進樣分析，于207 nm 檢測10-羥基-2-癸烯酸，230 nm 檢測苯甲酸，測定峰面積，計算10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸的含量，并按原料蜂王漿中10-羥基-2-癸烯酸100%轉移折算，計算原料蜂王漿中10-羥基-2-癸烯酸含量。測定結果分別見表2。

表2 樣品含量測定結果（n=2）

2.6 樣品聚類分析

聚類分析是一種通過數據建模簡化數據的方法，依據研究對象的某些特征加以歸類，建立樣本間的相似關系，現已廣泛應用于中藥及其制劑的質量評價中。采用TBtools 進行聚類熱圖分析，其中橫向聚類樣品，縱向聚類色譜峰，熱圖顏色代表峰面積，熱圖分析結果顯示11 批樣品化學成分比例有差異：3 號峰為苯甲酸，熱圖顏色可直觀顯示企業A 中S5 號樣苯甲酸含量最低，因而偏離同企業其他批次樣品；7 號峰為10-羥基-2-癸烯酸，企業E（S9）和企業F（S11）樣品中10-羥基-2-癸烯酸含量比較低；峰1、2、4、5、6 在各樣品中差異較大，峰1、峰4 成分在企業A（S1、S2、S3、S4、S5）、企業B（S6、S10）、企業D（S8）中含量很低，峰2 成分在企業D（S8）、企業E（S9）、企業F（S11）中含量很低，峰5、峰6 成分在企業F（S11）中含量最低，其次在企業D（S8）中含量也很低。樣品熱圖聚類分析結果表明相同生產企業的樣品質量一致性相對較好，而不同生產企業的樣品間的質量一致性較差。因腦心舒口服液生產工藝簡單，無提取過程只有簡單的混合工序，質量差異主要來源于其原料蜜環菌、蜂王漿、蜂蜜、防腐劑的差異。分析圖見圖2。各企業色譜圖見圖3。

圖2 聚類熱圖分析圖

圖3 企業A、B、C、D、E、F樣品色譜圖（207 nm）

3 討論

3.1 成分分析

6 家企業11 批樣品全部執行的是國家藥品監督管理局國家藥品標準 WS3-B-3975-98-2002，標準中按化學反應、薄層鑒別、相對密度、pH 值、裝量、微生物限度檢查項檢驗全部合格，但是產品中有效成分10-羥基-2-癸烯酸含量差別較大，最高達2.36 mg/支，最低只有0.44 mg/支，而標準WS-11356（ZD-1356）-2002-2012Z、WS3-B-3975-98-2002-1 中分別規定10-羥基-2-癸烯酸含量不得低于2.0 mg/支、2.5 mg/支，而本次流通環節抽檢的6個廠家11 批產品中10-羥基-2-癸烯酸含量全部低于2.5 mg/支，3 個廠家4 批次產品低于2.0 mg/支，說明執行WS3-B-3975-98-2002 標準的腦心舒口服液產品有效成分10-羥基-2-癸烯酸含量普遍偏低。GB9697-2008《蜂王漿》國家標準強制性要求理化指標10-羥基-2-癸烯酸≥1.4%為合格品，≥1.8%為優等品。ISO12824《蜂王漿》國際標準要求10-羥基-2-癸烯酸≥1.4%。腦心舒口服液處方工藝較為簡單，按原料蜂王漿中10-羥基-2-癸烯酸100%轉換折算，11 批產品中原料蜂王漿中10-羥基-2-癸烯酸含量最高0.94%，最低只有0.18%，普遍含量偏低。10-羥基-2-癸烯酸有多種藥理活性作用，又是蜂王漿中特征性成分，是衡量蜂王漿品質的重要理化指標。此結果表明腦心舒口服液中原料蜂王漿質量參差不齊。腦心舒口服液生產中無提取過程，只有簡單的混合工序，樣品間的差異主要來源于原料的差異。聚類分析顯示，各企業間產品色譜峰信息差異較大，表明不同生產企業腦心舒口服液原料蜜環菌、蜂王漿、蜂蜜等質量的差異。成品執行質量標準太低，無法有效控制腦心舒口服液的質量，腦心舒口服液的質量標準亟待完善和提升。

3.2 防腐劑苯甲酸含量分析

防腐劑抑制微生物的生長和繁殖，延長藥品的保存期限，但過量攝入防腐劑會對人體產生危害，如苯甲酸類對咽喉、胃黏膜均有一定的刺激性。口服液體制劑通常選用苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酯類防腐劑，苯甲酸的用量不得超過0.3%（鉀鹽、鈉鹽用量分別按酸計），腦心舒口服液中加防腐劑苯甲酸鈉，本實驗測得苯甲酸鈉（以苯甲酸計）含量0.13%～0.22%，均低于0.3%，其中8 批產品苯甲酸含量0.20%～0.22%，均符合要求。WHO 規定苯甲酸日允許總攝入量為5 mg/kg 。GB2760-2011 食品添加劑使用標準中苯甲酸濃縮果蔬汁（僅限食品工業用）中限度為0.2%，其余醬油、醋、風味飲料限度為0.1%，其他果酒、配制酒限度為0.08%、0.04%。所以腦心舒口服液作為滋補強壯、鎮靜安神滋補類藥物，其用量一定嚴格按照說明書用法用量服用（口服，一次10 mL，一日3 次）［10］，不可當普通營養液超劑量隨意服用。作為滋補常用藥品，生產企業有待對產品原有老工藝用的防腐劑類型和質量進一步優化。