HPLC 法同時(shí)測(cè)定六味安消片中大黃素、大黃酚及沒食子酸的含量

郭新強(qiáng)，姜軍華

1.江西省樟樹市藥品檢驗(yàn)所，江西 樟樹 331200；2.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

六味安消片在六味安消膠囊基礎(chǔ)上改劑型而來［1］，是由土木香、大黃、山柰、寒水石（煅）、訶子、堿花6 味藥加工而成的復(fù)方制劑，方中土木香健脾和胃、行氣止痛，為君藥；大黃攻積導(dǎo)滯，且能活血化瘀，輔助君藥行氣導(dǎo)滯止痛，為臣藥；訶子澀腸止瀉，以防瀉下太過傷正，與山柰、寒水石（煅）、堿花共為佐藥，諸藥相合，共奏和胃健脾，消積導(dǎo)滯，活血止痛之功。六味安消片在臨床用于治療慢性胃腸炎，便秘等［2-3］。該制劑標(biāo)準(zhǔn)為：國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ12202006-2009Z。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定方法過于復(fù)雜，且只控制了大黃一味藥的含量，故本研究采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定六味安消片中沒食子酸、大黃素及大黃酚的含量測(cè)定，能同時(shí)控制訶子和大黃的含量，可為六味安消片的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津LC-20AD 高效液相色譜儀，島津Lab Solutions 工作站，PDA 檢測(cè)器；色譜柱：ACE Excel 5 C18-AR 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；KQ-500E型超聲清洗器；ML204 型電子天平（梅特勒）；德國賽多利斯Secura 125-1CN 分析天平（十萬分之一）。

沒食子酸（批號(hào)：110831-201906）、大黃素（批號(hào)：110756-201913）和大黃酚（批號(hào)：110796-201922），含量分別為 91.5 %、96.0%和 99.4%，均購自中國食品藥品檢驗(yàn)研究院。六味安消片為薄膜衣片，規(guī)格為0.51 g/片，為江西博士達(dá)藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為：171102、171103、171106、171201、171205、171209；陰性樣品：取缺訶子、大黃的其余各藥材，按處方量及工藝自制陰性；水為超純水，乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 5 C18-AR 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：乙腈,流動(dòng)相B：0.1%磷酸溶液。梯度洗脫（0～8 min，5%～8%A；8～9 min，8%～85%A；9～30 min，85%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長：254 nm。理論塔板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算不低于3 000。

1.3 溶液的制備

1.3.1對(duì)照品溶液 分別精密稱取沒食子酸、大黃素和大黃酚適量，加甲醇制成每1 mL 含沒食子酸65 μg、大黃素5 μg、大黃酚10 μg 的混合溶液，即得。

1.3.2 供試品溶液取六味安消片10 片，除去包衣，精密稱定，置于研缽中研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密量取甲醇25 mL 加入錐形瓶中，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）1 h，放冷，再進(jìn)行稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。

1.3.3 陰性對(duì)照品溶液取自制陰性樣品，按“1.3.2”方法制備缺大黃和訶子的溶液，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性試驗(yàn)分別取混合對(duì)照溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1。由圖可知，各成分色譜峰分離效果佳，分離度均大于1.5，陰性樣品在三種待測(cè)成分位置處無干擾［4-6］，說明該方法專屬性佳。

圖1 專屬性試驗(yàn)的HPLC色譜圖

2.1.2 線性關(guān)系的考察分別精密吸取“1.3.1”中三種組分的混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20 μL 依次進(jìn)行測(cè)定，用島津高效液相色譜儀進(jìn)行分析，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1，三種成分在各自范圍內(nèi)呈良好的線性。

表1 三種成分線性關(guān)系

2.1.3 精密度試驗(yàn)精密吸取“1.3.1”中三種成分混合對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算各組分峰面積的RSD，測(cè)得沒食子酸、大黃素、大黃酚峰面積RSD 分別為0.17%、0.27%、0.17%。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取“1.3.2”項(xiàng)制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、20 h 進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、大黃素、大黃酚峰面積RSD 分別為0.50%、0.35%、0.21%（n=6），表明樣品溶液制備后20 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批薄膜衣片（批號(hào)：171103），按“1.3.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，照“2.1”項(xiàng)下方法，依法測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、大黃素、大黃酚含量結(jié)果RSD 分別為1.32%、0.51%、1.16%（n=6），結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn)取同一批薄膜衣片（批號(hào)：171103）適量，除去包衣，精密稱定，置研缽中研細(xì)，平行取樣6 份，每份0.25 g，精密稱定，分別置錐形瓶中，精密加入含適量混合對(duì)照品的甲醇溶液（沒食子酸濃度0.045 33 mg/mL、大黃素濃度0.003 454 mg/mL、大黃酚0.006 214 mg/mL）25 mL，照“1.3.2”項(xiàng)下方法試驗(yàn)，照“2.1”項(xiàng)下方法，依法測(cè)定，結(jié)果測(cè)得沒食子酸平均加樣回收率為101.32%，RSD1.13%（n=6），大黃素平均加樣回收率為98.42%，RSD1.95%（n=6），大黃酚平均加樣回收率為100.12%，RSD1.25%（n=6），適合本品的含量測(cè)定。

2.2 樣品測(cè)定

分別對(duì)收集的6 批六味安消片，采用“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 三種成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 提取方法的比較

方中臣藥大黃主要含有大黃素、大黃酚等蒽醌衍生物［7-12］，以少部分游離性、大部分結(jié)合型蒽醌存在。測(cè)定“總大黃素和總大黃酚的總量”時(shí)存在水解產(chǎn)生的雜質(zhì)在部分色譜柱上會(huì)與大黃素共同流出［13-14］，存在干擾,導(dǎo)致測(cè)定的含量異常偏高，測(cè)定總蒽醌時(shí)提取繁瑣，分析時(shí)為防止水解雜質(zhì)干擾，分析時(shí)間長。而采用超聲提取，這些缺陷均得以克服。

3.2 流動(dòng)相的選擇

比較了乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸溶液，甲醇-乙腈-水三種流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)前2種流動(dòng)相均可以得到較好分離，無需采用甲醇-乙腈-水三相進(jìn)行分離。同時(shí)發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.1%磷酸溶液峰形在三者中最佳。綜合考慮，選用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫分離三種成分。

3.3 檢測(cè)波長的篩選

本試驗(yàn)采用PDA 檢測(cè)器，在紫外光區(qū)（190～400 nm）對(duì)所測(cè)成分進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果沒食子酸在217 nm 波長處有最大吸收，但為末端吸收,樣品中峰雜質(zhì)大，而大黃素及大黃酚檢測(cè)波長在254 nm處有最大吸收，而沒食子酸在254 nm 下吸收較大，故最終確定作為三者的檢測(cè)波長。

4 結(jié)論

采用HPLC 法同時(shí)對(duì)六味安消片中沒食子酸、大黃素、大黃酚進(jìn)行含量測(cè)定。該方法準(zhǔn)確度高、操作簡便、重現(xiàn)性好，為六味安消片提供了多指標(biāo)質(zhì)量控制依據(jù)。