骨關節(jié)炎患者免疫炎癥關鍵蛋白表達譜變化及中醫(yī)藥的干預研究①

鮑丙溪 劉 健 萬 磊 黃 旦 張 穎 龍 琰 孫廣瀚

（安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，合肥230031）

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是關節(jié)疾病中較常見的，全球約有2.5億人，占所有關節(jié)疾病的40%左右［1-2］。近年來，骨關節(jié)炎的患病率和負擔大大增加，生活水平的提高、人口老年化和肥胖人口的增加也成為發(fā)病率增高的因素［3-4］。

關節(jié)軟骨的破壞是OA最顯著的特征，包括滑膜、Ⅱ型膠原、聚集蛋白多糖、軟骨下骨和關節(jié)周圍軟組織的破壞，并伴有關節(jié)功能障礙［5-6］。骨關節(jié)炎主要表現為膝關節(jié)疼痛、腫脹、壓痛、僵硬，嚴重活動性腫脹，甚至不能活動［7］。除了關注疾病，我們還需要關注與疾病相關的生理、心理和社會互動。與其他慢性疾病相比，OA患者的歲數相對較低。OA不僅給患者帶來疼痛，而且對其自身的社會交往也有很大影響，造成負面情緒，導致患者感受降低［8］。

本研究采用Raybiotech抗體芯片檢測OA患者體內與免疫炎癥相關蛋白的變化情況，應用ELISA進行驗證，并探究中醫(yī)藥對OA患者變化的差異蛋白及實驗室指標的影響，探究其改善OA的作用機制。

1 資料與方法

1.1 資料 收集10例OA患者和10例健康人，利用蛋白芯片進行關鍵蛋白篩選。30例OA治療前后患者和30例健康人，利用ELISA進行關鍵蛋白驗證，所有實驗組檢測樣本均來自2018年12月至2019年2月安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕科住院患者，健康對照組來自醫(yī)院健康體檢中心。兩組數據在年齡、性別上無差異。本研究獲得我院倫理委員會的批準（倫理審查號：2014AH-06），患者知情且簽署同意書。①診斷標準：西醫(yī)診斷標準按照1995年美國風濕病學會（ACR）修訂的診斷標準［9］及2007年中華醫(yī)學會骨科學分會骨關節(jié)炎診斷及治療指南［10］。②排除標準：排除合并其他風濕性疾病，排除嚴重原發(fā)性心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病、妊娠期及哺乳期婦女、患有精神疾病無法配合的患者。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 實驗組：新風膠囊聯合中藥飲片口服（新風膠囊：由薏苡仁、黃芪、蜈蚣、雷公藤組成，安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑，皖藥制Z20050062，規(guī)格：0.34 g∕粒，3粒∕次，3次∕d；中藥湯劑內服，1劑∕d，早晚分服），對照組：僅內服中藥湯劑，1劑∕d。

1.2.2 數據分析

1.2.2.1 OA患者免疫炎癥差異蛋白篩選 芯片掃描得到的原始數據經Raybiotech軟件進行芯片背景去除、芯片間歸一化處理。然后選擇Result數據來做分析。兩組間比較分析方法為moderated t-statistics，數據包為limma，來自R∕Bioconductor；采用adjustPvalue（或Pvalue）和logFC（表達差異倍數，以2為底）對差異蛋白進行篩選；3組比較分析方法為One-way ANOVA，數據包為stats。

1.2.2.2 生物信息學分析 主成分分析（PCA）和基因本體分析（GO）分別鑒定了差異表達蛋白及其功能。京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析差異表達蛋白具有的主要生物學功能及其參與的主要生化代謝和信號轉導途徑。層次聚類分析差異蛋白表達模式。PCA數據包“ggfortify”、GO及KEGG富集分析數據包“clusterProfiler”、層次聚類分析數據包“gplots”。

1.2.2.3 關聯規(guī)則分析 關聯規(guī)則中將治療后指標改善設為T，反之為F，前項為中藥或新風膠囊聯合中藥，后項為關鍵蛋白和免疫炎癥實驗室指標。設定最小支持度及置信度，若生成的關聯規(guī)則中所有數據大于最小設定值，則被稱為強關聯規(guī)則［11］，計算公式如下［12］：

1.2.2.4 觀察指標 關鍵蛋白：B7-1、ICOS、PD-L2；免疫炎癥指標：免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、補體C3、補體C4、血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）；患者感受相關指標：患者焦慮量表（SAS）、患者抑郁量表（SDS）、SF-36量表（生理機能PF、生理職能RP、軀體疼痛BP、一般健康GH、精力VT、社會功能SF、情感職能RE、精神健康MH）。

1.3 統(tǒng)計學分析 數據用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以±s表示，計數資料以率表示，治療前后應用配對t檢驗，多組數據比較采用One-way ANOVA檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蛋白芯片篩選OA免疫炎癥相關蛋白 選取OA組10例，男1例，女9例，平均年齡（59.8±9.5）歲；對照組10例，女8例，男2例，平均年齡（58.0±9.3）歲，兩組年齡、性別基線差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。ELISA驗證OA免疫炎癥相關蛋白，選取OA患者治療前及治療后30例，女24例，男6例，平均年齡（60.6±10.6）歲；對照組30例，女性26例，男性4例，平均年齡（55.3±8.9）歲，兩組年齡、性別基線差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 抗體芯片檢測OA患者血清蛋白表達譜

2.2.1 OA潛在生物標志物的鑒定 通過火山圖（圖1A）和散點圖（圖1B）對OA組蛋白與Control組蛋白進行比較，結果表明，OA組血清蛋白表達與Control組有顯著差異。其中OA組3個蛋白較Control組有顯著變化，OA組B7-1、ICOS、PD-L2均下調。

2.2.2 OA患者血清蛋白表達譜 圖1A火山圖表示有3個差異蛋白表達；圖1B中藍色表示下調蛋白，紅色表示上調蛋白；圖1C中紅色表示對照組，藍色表示OA患者，其中各樣本前兩個主成分（PC1和PC2）顯示，總變異率為84.05%和15.03%（圖1C），提示OA患者與對照組的蛋白表達模式存在差異；圖1D為差異蛋白熱圖，將樣本分為4個主要類群，第一類群包括3例OA患者和6例對照組，第二類群包括3例OA患者和1例對照組，第三類群僅包括3例OA患者，第四類群包括1例OA患者和3例對照組。

圖1 OA患者和對照組蛋白表達譜Fig.1 Protein expression profiles of OA patients and con?trols

2.2.3 生物信息學分析 通過GO富集分析顯示，有顯著功能項25個，其中BP功能項20個（圖2A），MF功能項3個（圖2B），CC功能項2個（圖2C）。KEGG富集分析顯示，DEPs在12個途徑中顯著富集（圖2D）。以上富集的信息和信號通路可能反映了OA的發(fā)病機制。

圖2 OA生物信息學分析Fig.2 OA bioinformatics analysis

2.3 關鍵蛋白驗證 選取30例治療前后OA患者，通過ELISA對芯片篩選出的3個與OA免疫驗證相關的蛋白進行驗證，結果顯示，OA組與對照組相比較，B7-1、ICOS、PD-L2（圖3）3個蛋白顯著下調（P＜0.01）。

圖3 ELISA驗證差異蛋白變化Fig.3 Changes of DEPs were verified by ELISA

2.4 OA患者治療前關鍵蛋白與相關指標的相關性分析 利用Spearman相關性檢驗，結果顯示ICOS與ESR、CRP、補體C3、補體C4及BP呈顯著負相關，B7-1與SAS呈顯著正相關（圖4）。

圖4 關鍵蛋白與相關指標的相關性分析Fig.4 Correlation analysis of key proteins and related indexes

2.5 OA患者治療前后差異蛋白及相關指標改善情況 選取30例治療前后OA患者，比較OA患者治療前后差異蛋白及相關指標改善情況，結果顯示OA患者治療后B7-1、ICOS和PD-L2（P＜0.01），ESR、補體C4、SAS和BP（P＜0.05）均有明顯改善，差異具有統(tǒng)計學意義（圖5）。

圖5 OA患者治療前后蛋白及相關指標變化情況Fig.5 Changes of protein and related indexes in OA patients before and after treatment

2.6 兩組患者治療前后差異蛋白及相關指標改善情況 選取30例治療后OA患者，其中對照組19例，實驗組11例，比較對照組和實驗組患者治療后相關指標情況，結果顯示實驗組治療后患者的CRP和IgA的改善情況相比對照組（圖6），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖6 兩組患者治療前后差異蛋白及相關指標變化情況Fig.6 Changes of DEPs and related indexes before and after treatment in two groups

2.7 中藥與患者實驗室指標及其他相關指標的關聯規(guī)則分析 選取30例OA患者，調取患者使用中藥情況，設定前項為單味中藥，設定后項為免疫炎癥相關差異蛋白和免疫炎癥實驗室指標，設置最小支持度為50%，最低置信度為90%，經Aprior模塊分析，差異蛋白B7-1的上升與陳皮、蒲公英有強關聯；ICOS的上升與牡丹皮、蒲公英、丹參有強關聯；PD-L2的上升與桃仁、山藥和薏苡仁有強關聯，以上結果支持度均＞50%，置信度＞90%，提升＞1，見表1。

表1 對照組與差異蛋白的關聯規(guī)則分析Tab.1 Analy association rules between control group and related indexes

設定前項為新風膠囊聯合中藥，設定后項為免疫炎癥相關差異蛋白和免疫炎癥實驗室指標，設置最小支持度為30%，最低置信度為70%，經Aprior模塊分析，IgA、IgG、ESR和CRP的下降及差異蛋白ICOS、PDL2的上升均與新風膠囊聯合山藥有強關聯，以上結果支持度均＞30%，置信度＞70，提升＞1，見表2。

表2 實驗組與差異蛋白及免疫炎癥實驗室指標的關聯規(guī)則分析Tab.2 Association rule analysis of experimental group and relevant laboratory indexes

3 討論

OA是一種退行性骨關節(jié)疾病，以慢性滑膜炎、關節(jié)軟骨變性和軟骨下骨重塑為特征［13］。紅細胞沉降率（ESR）和c反應蛋白（CRP）是顯著反映炎癥變化的指標。ESR和CRP濃度是診斷膝關節(jié)疼痛（包括并發(fā)癥）的重要診斷方法。另外補體系統(tǒng)是先天免疫的重要組成部分，在OA患者滑膜和滑膜組織中可以檢測到［14］。修復軟骨紊亂引起的軟骨細胞外基質的釋放以及軟骨細胞凋亡特征的改變所致的病理變化，與激活補體系統(tǒng)有一定的關聯，能顯著增強OA的病理反應［15］。

ICOS是CD28家族的一員。ICOS信號在維持T淋巴細胞效應和記憶細胞活化、免疫球蛋白轉換、調節(jié)Th細胞極化等方面發(fā)揮重要作用［16］。ICOS及其特異性配體（ICOSL）有激活誘導和調控免疫應答的特征，推測ICOS∕ICOSL信號可能參與OA的發(fā)生發(fā)展，從而參與調節(jié)OA的免疫損傷和免疫紊亂［17］。B7-1蛋白表達于抗原呈遞細胞（APC）表面，在固有免疫系統(tǒng)中的作用是在免疫激活和免疫抑制之間建立平衡關系。B7-1及其受體，包括CD28、CTLA4和PD-L1，對機體的穩(wěn)定起著調節(jié)控制作用［18］。PDL2是B7-DC家族成員，是抑制T細胞免疫應答的重要調控分子，參與多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)病機制［19］。關于B7-1和PD-L2在骨關節(jié)炎中的作用，相關文獻較少，尚需進行大量的臨床研究或者動物實驗研究。

本研究使用蛋白芯片來分析OA患者和對照組血清中關鍵免疫炎癥蛋白的表達，獲得3個差異蛋白并進行相關蛋白分析（GO、KEGG pathway、PCA），以了解OA新的發(fā)病機制。GO和KEGG富集分析表明，免疫炎癥的關鍵蛋白在OA的發(fā)生中起關鍵作用。蛋白芯片篩選結果顯示，與OA相關的關鍵蛋白為ICOS、B7-1和PD-L2，經ELISA驗證，其表達較對照組下調（P＜0.01）。中醫(yī)治療OA以安全、費用低、患者痛苦小，可以改善患者關節(jié)功能及生活質量而更容易被患者所接受。本次研究結果顯示：通過相關性分析，ICOS與ESR、CRP、補體C3、補體C4及BP呈顯著負相關，B7-1與SAS呈顯著正相關，與臨床實際相符合；OA患者治療后B7-1、ICOS、PD-L2、ESR、補體C4、SAS和BP均有明顯改善（P＜0.05）；比較單純中藥組和中藥聯合新風膠囊組患者治療后相關指標情況，結果顯示使用中藥聯合新風膠囊治療后患者的CRP和IgA的情況較使用單純中藥治療后改善較好；通過中藥與相關指標進行關聯規(guī)則分析，結果顯示差異蛋白B7-1的上升與陳皮、蒲公英有強關聯；ICOS的上升與牡丹皮、蒲公英、丹參有強關聯；PD-L2的上升與桃仁、山藥和薏苡仁有強關聯，IgA、IgG、ESR和CRP的下降及差異蛋白ICOS、PD-L2的上升均與新風膠囊聯合山藥有強關聯。研究表明陳皮、蒲公英、丹參、桃仁和山藥等有抗炎、抗菌、調節(jié)免疫的作用［20-24］，對調節(jié)差異蛋白有著重要作用；新風膠囊是延續(xù)新安從脾治痹思想的基礎上研制的中成藥［25-27］，通過關聯規(guī)則分析可知新風膠囊與山藥聯合使用可以對免疫炎癥指標及關鍵蛋白的調節(jié)有重要的作用，這與新風膠囊的藥物組成可能有密切聯系。新風膠囊主要由黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣等組成。組方中各藥都具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛的效果。黃芪、薏苡仁有益氣健脾作用，能夠調節(jié)雷公藤的毒副作用造成患者免疫力低下的不良反應。現代藥理研究證明，黃芪能增加巨噬細胞的數量以及提高其吞噬能力［28］。雷公藤具有祛風濕、活血化瘀、通絡止痛的作用，能抗炎鎮(zhèn)痛、抑制白介素等細胞因子的表達，從而達到良好的治療效果［29］。文建庭等［30］通過數據挖掘的方法研究新風膠囊聯合中藥與單純中藥治療OA療效差別，研究顯示經過隨機行走模型的分析，新風膠囊聯合中藥在降低OA患者ESR和hs-CRP的效果優(yōu)于單純中藥組；汪元等［31］觀察中藥內服外敷對OA的療效，發(fā)現新風膠囊聯合中藥內服與外敷在改善ESR、ALP、PLT、SOD等方面優(yōu)于硫酸氨基葡萄糖組，對患者的生活質量也有一定的改善；談冰等［32］研究也發(fā)現新風膠囊治療OA患者，在降低P65、TRAF、IL-17、hs-CRP、ESR，升高IL-4方面明顯優(yōu)于硫酸氨基葡萄糖組。新風膠囊在臨床應用數年，在治療骨關節(jié)炎上療效顯著。

應用蛋白芯片檢測OA患者血清中與免疫炎癥相關的蛋白表達情況，進一步明確RA的發(fā)病機理，發(fā)現新的診斷標志物。從上述研究可知，中醫(yī)藥對改善骨關節(jié)炎關鍵蛋白的表達有重要的作用，尤其是新風膠囊聯合中藥不僅在改善關鍵蛋白上有明顯作用，在對免疫炎癥實驗室指標的改善上同樣發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。由于骨關節(jié)炎的蛋白表達研究相對較少，其機制還需進一步研究驗證。