基于生物信息學分析PRMT5在頭頸鱗癌中的表達及臨床意義

王 楠，黃軒宇

（嘉應學院生命科學學院/廣東省山區(qū)特色農業(yè)資源保護與精準利用重點實驗室，廣東 梅州 514015）

頭頸鱗癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是人體常見的惡性腫瘤之一，2018 年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，頭頸部癌癥年新發(fā)病例約70 萬，死亡病例約35 萬，其發(fā)病率和死亡率正逐年增加，已成為危害生命健康的重要疾病之一[1，2]。頭頸部癌癥常發(fā)生于口腔頜面部、咽、喉、鼻腔/鼻竇等部位，其中90%以上組織病理類型為鱗狀細胞癌。在目前較先進的治療標準下，中晚期患者的5 年生存率并沒有得到較大改善，發(fā)生頸部淋巴結轉移的患者5 年生存率僅30%～40%；發(fā)生遠處轉移時，患者5 年生存率不足20%[3，4]。迄今為止，臨床上對頭頸鱗癌患者的診斷、治療和預后都是以TNM 分期為依據(jù)來制定和判斷，逐步建立有效的個性化評價指標和評價體系具有深遠意義。因此，深入探究頭頸鱗癌轉移的分子機制及影響預后的因素，尋找可用于分子診斷及靶向治療的腫瘤標記物，是頭頸鱗癌治療中亟待解決的問題。精氨酸甲基轉移酶5（PRMT5)是PRMT 蛋白家族成員之一，屬于Ⅱ型精氨酸甲基化轉移酶，可以通過甲基化組蛋白或非組蛋白實現(xiàn)對基因的轉錄調控[5]。PRMT5 還可與多種不同的表觀遺傳調控復合物結合，通過調節(jié)靶基因的表達參與細胞增殖、DNA 復制、細胞周期、侵襲和轉移等過程[6-8]。有研究報道[9]，在上皮樣腫瘤中的PRMT5 可以與Snail 結合，抑制E-cadherin 蛋白表達，導致細胞發(fā)生惡性轉化促進腫瘤轉移。PRMT5 高表達水平直接與腫瘤的進程及不良預后密切相關[10，11]。PRMT5 的抑制劑GSK591 能夠在體外顯著抑制小鼠細胞的增殖，誘導凋亡[12]。這些研究表明PRMT5可能是潛在的癌基因，但其調控頭頸鱗癌進展的研究國內外開展甚少。本研究通過多種生物信息學數(shù)據(jù)庫挖掘PRMT5 在頭頸鱗癌中的表達情況，探討PRMT5 在頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為PRMT5在頭頸鱗癌中的機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 UALCAN-TCGA 數(shù)據(jù)庫分析 UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）[13]是一個有效的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘工具，主要是基于TCGA 數(shù)據(jù)庫的在線分析和挖掘。利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 在頭頸鱗癌中的表達情況。檢索條件如下：①在Enter gene symbol 輸入PRMT5；②TCGA dataset Select cancer 欄選擇Head and Neck squamous cell carcinoma，點擊Explore；③Links for analysis 選擇Expression。

1.2 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA 數(shù)據(jù)庫是一個高度可視化數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫整合了TCGA 癌癥大數(shù)據(jù)和GTEx 正常組織大數(shù)據(jù)[14]。運用該數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 表達與頭頸鱗癌患者的預后及分析其與免疫檢查點基因之間的相關性。檢索條件如下：①在Enter gene name 檢索欄輸入PRMT5，點擊GoPIA! ；②Survival 選擇Survival plots；③Datasets Selection（Cancer name）選擇HNSC。

1.3 HPA 數(shù)據(jù)庫分析 HPA（https://www.proteinatlas.org/）是目前最大、最全面的人類組織細胞蛋白空間分布數(shù)據(jù)庫。本研究利用HPA 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 蛋白在正常組織和頭頸鱗癌組織中的表達差異。檢索條件如下：①在檢索欄直接輸入：PRMT5，點擊Search；②PROTEIN EXPRESSION OVERVIEW：Oral mucosa；③選擇合適的正常口腔組織細胞PRMT5 蛋白表達圖；④點擊PRMT5 欄中的Pathology；⑤PROTEIN EXPRESSION SUMMARY：Head and neck cancer。

1.4 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫分析 利用Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/）[15]分析PRMT5 mRNA 表達與頭頸鱗癌患者病理特征和總生存期（OS）的關系。檢索條件如下：①點擊mRNA（RNA-seq）列的Start KM Plotter pan-cancer；②Caner：Head-neck squamous cell carcinoma（n=500）；③Gene symbol：PRMT5；④Split patients by：選擇median；⑤Restrict analysis to subtypes：選擇all。

1.5 TIMER 數(shù)據(jù)庫分析 TIMER（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）是利用RNA-seq 表達譜數(shù)據(jù)檢測腫瘤組織中免疫細胞浸潤情況[16]。TIMER 提供（CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、B 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞）6 種免疫細胞的浸潤情況。利用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析頭頸鱗癌內PRMT5 基因表達和六種免疫細胞浸潤比例之間的關系。檢索條件如下：①點擊SCNA，在Cancer Types：選擇HNSC；②Gene symbol：輸入PRMT5，點擊Submit。

1.6 STRING 數(shù)據(jù)庫分析 STRING 11.0（https://string-db.org/）是研究蛋白質相互作用的數(shù)據(jù)庫，可進行已知蛋白與預測蛋白之間的相互作用分析，包括直接相互作用和間接相互作用。本研究利用STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 蛋白與其它蛋白的相互作用，檢索條件如下：①數(shù)據(jù)庫中輸入“PRMT5”；②在List Of Name 下方的Orginsim 選擇Homo sapiens；③最后點擊SEARCH 進行構建蛋白質互作網(wǎng)絡然后導出tsv 文本文件；④用Cytoscape 3.7.2 打開導出的tsv 文件，用Cytohubba 插件對蛋白質相互作用網(wǎng)絡進行關聯(lián)度分析，并運用MCC 算法得到hub 基因。

1.7 統(tǒng)計學方法 利用SPSS 24.0 軟件分析PRMT5表達水平與臨床病理參數(shù)間的關系，Spearman 相關系數(shù)分析GEPIA 數(shù)據(jù)庫中的基因表達相關性。采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析生存率，Log-rank 檢驗估計生存率的差異。通過TIMER 數(shù)據(jù)庫中的GENE 模塊分析PRMT5 基因與免疫浸潤水平的關系。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PRMT5 在HNSC 癌組織和癌旁組織的差異表達從GEO 數(shù)據(jù)庫中檢索與頭頸鱗癌相關的基因表達數(shù)據(jù)集GSE85195，用于基因表達的差異分析。以log fold change＞2 和P＜0.05 為篩選閾值，共鑒定出1911 個基因在口腔鱗狀細胞癌組織和癌旁正常組織中表達差異明顯（圖1A），其中PRMT5 呈高表達。通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 在頭頸鱗癌中的mRNA 表達情況，發(fā)現(xiàn)PRMT5 mRNA 在頭頸鱗癌組織中的表達高于正常組織（圖1B）。

圖1 PRMT5 在頭頸鱗癌組織及正常組織中的表達

2.2 PRMT5 表達量與頭頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)的相關性 通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，TNM 臨床分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期頭頸鱗癌患者組織中PRMT5基因表達水平均高于正常組織（圖2A），Ⅲ期、Ⅳ期頭頸鱗癌患者PRMT5 基因表達水平高于Ⅰ期頭頸鱗癌組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PRMT5 高表達與頭頸鱗癌腫瘤分級相關（圖2B）。利用KMplotter 數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)整合，發(fā)現(xiàn)PRMT5 的表達水平與性別、等級、AJCC 臨床分期及頭頸鱗癌患者總生存率相關，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 PRMT5 基因表達與頭頸腫瘤臨床病理因素的相關性

圖2 PRMT5 在頭頸鱗癌不同臨床分期和腫瘤分級中的表達

2.3 PRMT5 基因在頭頸鱗癌中的預后分析 通過過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 與頭頸鱗癌患者的預后，結果顯示PRMT5 高表達患者的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）較PRMT5 低表達患者顯著降低（OS：P=0.0055，HR=1.5；DFS：P=0.041，HR=1.4），見圖3。

圖3 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 對頭頸鱗癌患者總生存期和無病生存期的影響

2.4 PRMT5 表達與頭頸鱗癌免疫細胞浸潤的關系運用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 表達與頭頸鱗癌免疫細胞浸潤的相關性，結果表明PRMT5 基因表達與細胞純度、B 細胞、CD8+T 細胞、中性粒細胞的免疫浸潤水平具有一定相關性（圖4A），可能參與頭頸鱗癌細胞的免疫浸潤過程；另外頭頸鱗癌組織與正常組織相比，PRMT5 不同拷貝狀態(tài)對免疫浸潤具有一定影響（圖4B）。

圖4 PRMT5 表達與頭頸腫瘤免疫細胞浸潤的關系

2.5 PRMT5 與免疫檢查點之間相關性分析 通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 基因表達與頭頸鱗癌中免疫檢查點基因的相關性，結果提示PRMT5 基因與CD276、PD-L1、PVR 和TNFRSF18 等免疫檢查點基因的表達水平呈正相關，見圖5。

圖5 頭頸腫瘤中PRMT5 表達與免疫檢查點基因的相關性

2.6 PRMT5 在頭頸鱗癌組織中的表達分析 利用HPA 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 蛋白在正常組織和頭頸鱗癌組織中的表達差異，結果顯示PRMT5 在頭頸鱗癌組織中的表達高于正常組織，見圖6。

圖6 PRMT5 在頭頸組織和正常對照組織中的表達差異

2.7 PRMT5 蛋白相互作用網(wǎng)絡分析 用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 蛋白與其它蛋白的相互作用，得到可能與PRMT5 相互作用的蛋白互作網(wǎng)絡結果，使用Cytoscape 中的插件Cytohubba 運用MCC 算法得到10 個樞紐基因，即CDK6、HIST1H4A、PRMT1、CLNS1A、COPRS、WDR77、SNRPD3、HIST4H4 和HIST2H2AC，見圖7。

圖7 PRMT5 相互作用的蛋白網(wǎng)絡圖

3 討論

頭頸鱗癌是頭頸部腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一。在過去的幾十年，盡管手術、放化療等綜合治療手段不斷改善，但是頭頸鱗癌患者的預后仍然較差，總體生存率維持在40%～60%。頭頸鱗癌的復發(fā)和轉移一直是患者死亡的主要原因。雖然病理分級、腫瘤分期和淋巴結轉移等因素與患者預后相關，但這些指標尚不足以精確評估頭頸鱗癌患者的預后。因此，深入研究頭頸鱗癌的發(fā)病機制、尋找影響其預后的因素及可用于診斷和治療的分子靶點，對實現(xiàn)頭頸鱗癌的個體化治療具有重要意義。

PRMT5 是PRMTs 家族中最早被鑒定出來的成員，其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用被研究的最為深入。研究表明[9]，過表達的PRMT5 可促進細胞增殖和裸鼠體內腫瘤的形成。敲除PRMT5 的小鼠在3.5～6.5 d 胚胎致死，表明PRMT5 在胚胎發(fā)育中具有重要作用[17]。此外，敲除PRMT5 囊胚的胚胎干細胞ES 發(fā)育停滯，且分化基因表達上調而多能性基因表達下調，提示PRMT5 對維持干細胞的多能性是必需的[18]。PRMT5 的轉錄抑制作用使其在上皮-間質轉化過程中發(fā)揮重要的作用，從而影響腫瘤細胞的侵襲轉移[19,20]。這些研究表明PRMT5 可能是潛在的癌基因，但其調控頭頸鱗癌進展的分子機制研究較少。本研究通過生物信息學方法對公共數(shù)據(jù)庫中PRMT5 基因在頭頸鱗癌中的表達情況進行深入挖掘、分析，避免因樣本量、研究方法和人群個體差異導致的結果異質性。通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，PRMT5 mRNA 在頭頸鱗癌組織中的表達高于正常組織。這與有關報道[10，11]的研究結果一致，說明PRMT5 高表達水平直接與腫瘤的進程及不良預后密切相關。PRMT5 主要表達于細胞質，少量表達在細胞核，而對發(fā)生惡性轉化的細胞其定位則相反[21]。PRMT5 在多種腫瘤中高表達使其有望成為頭頸鱗癌及其他癌癥診斷的標志物。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，TNM 臨床分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期頭頸鱗癌患者組織中PRMT5 基因表達水平均高于正常組織，PRMT5 高表達與頭頸鱗癌腫瘤分期相關。利用HPA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，PRMT5 在頭頸鱗癌組織中的表達高于正常組織，進一步在蛋白水平證明了高表達PRMT5 與患者的臨床分期相關。通過Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫進行生存分析，發(fā)現(xiàn)PRMT5 高表達患者的總生存率較PRMT5 低表達患者降低，提示其表達與患者預后密切相關。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展其本質上是復雜的，包括異質的細胞成分和腫瘤免疫微環(huán)境。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉移的不同階段，細胞-細胞相互作用（除癌細胞外，還包括血管和免疫細胞）以及細胞-細胞外基質相互作用（如周圍基質的硬度和組成發(fā)生變化）起著主要作用。本研究利用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PRMT5 基因表達與細胞純度、B 細胞、CD8+T 細胞、中性粒細胞的免疫浸潤水平具有一定相關性，提示PRMT5 有可能參與頭頸鱗癌細胞的免疫浸潤過程。另外，頭頸鱗癌組織與正常組織相比PRMT5 不同拷貝狀態(tài)對免疫浸潤具有一定影響。進一步通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析得出PRMT5 基因與PD-L1、CD276、PVR 和TNFRSF18 等免疫檢查點基因的表達水平呈正相關。因此，PRMT5 表達與免疫檢查點基因表達分析的結果可以為頭頸鱗癌的免疫治療提供理論依據(jù)和研究新思路。

使用STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫進一步預測與PRMT5相互作用的蛋白，這些蛋白主要有CDK6、HIST1H4A、PRMT1、CLNS1A、COPRS、SNRPD1、WDR77、SNRPD3、HIST4H4 和HIST2H2AC。其 中CDK6 可 與PRMT5（p53 拮抗劑）的啟動子結合，通過驅動細胞周期進程和拮抗應激反應在p53 和RB 的界面發(fā)揮作用[22]。PRMT5 和PRMT1 相互作用，在聯(lián)合抑制劑治療小細胞肺癌和胰腺癌細胞模型中具有協(xié)同作用。此外，PRMT5 可與MEP50/WDR77 復合物結合發(fā)揮作用，這種活性通常在癌細胞中處于激活狀態(tài)，并與肺癌和胰腺癌不良預后相關，使PRMT5 成為治療靶點[23]。組蛋白結合蛋白COPR5 是PRMT5 發(fā)揮核功能所必需的，在惡性膠質瘤細胞中CLNS1A/RIOK1 的比例可作為PRMT5 抑制劑敏感性的標志物，PRMT5 敲除干擾了內含子（DIs）的去除。這種受損的DI 剪接影響增殖基因，其下調與細胞周期阻滯、衰老和/或凋亡相關，這些發(fā)現(xiàn)揭示了PRMT5 調控的雙剪接程序可作為癌癥治療的靶點[24，25]。

綜上所述，PRMT5 在頭頸鱗癌組織中高表達，其高表達與腫瘤的進程及不良預后密切相關；同時PRMT5 可能參與頭頸鱗癌細胞的免疫浸潤過程，并與一些免疫檢查點基因的表達相關；PRMT5 通過與其他蛋白的相互作用參與細胞凋亡、細胞增殖、細胞周期改變和代謝異常調控等過程，其有望成為頭頸鱗癌的診斷標志物和新的治療靶點。