不同檢測方法用于結核病診斷的研究

邱浩慶

結核病是由于結核分枝桿菌(Tuberculosis,TB)感染引發各系統出現的病理改變,具有傳染性,損傷人類生命健康,盡管當前已有抗結核藥物用于臨床治療,但是由于耐藥性的發生,近年來結核病的發病率有所增加,成為嚴重的公共衛生問題［1,2］。我國結核病患者數目位居世界前列,給社會和家庭帶來經濟和生活負擔,對結核分枝桿菌感染及早發現和診斷,做好防范措施,降低傳播風險,是控制結核病的重要環節［3］。當前實驗室檢測結核分枝桿菌的病原學方法包括病原學學檢查、分子生物學檢查和免疫學檢查,痰培養結核分枝桿菌陽性為細菌病原學檢測的金標準,2017 版的肺結核診斷標準新增分子生物學檢測陽性為肺結核確診情況之一［4,5］。本研究選擇60 例結核病疑似患者為研究對象,比較實時熒光定量PCR 法、抗酸染色實驗法和TB-IGRA法在結核病診斷中的敏感性和特異性等指標,評估其應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2019 年1 月～2020 年1 月在本院就診的60 例疑似肺結核病患者,根據臨床表現、病原學檢測、病理學診斷、影像學檢查和抗結核藥物治療確診為肺結核病的患者21 例,年齡15～67 歲,平均年齡(34.88±13.94)歲；確診為肺部其他疾病的患者39 例,年齡16～72 歲,平均年齡(35.71±12.89)歲,包括慢性阻塞性肺疾病、肺炎、支氣管擴張、肺癌等。納入及排除標準：確診為肺結核的患者符合《肺結核診斷標準》(WS 288-2017)［6］；確診為其他肺部疾病的患者未經過抗結核分枝桿菌治療；排除不配合研究的患者。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR 法 取痰樣本,用胰酶消化后離心,提取沉淀物中的TB-DNA,使用熒光定量PCR試劑盒(深圳匹基生物工程有限公司)進行TB 的核酸檢測,操作和結果判斷嚴格按照試劑盒的說明書進行,使用ABI 7500 PCR 儀進行結果判定。

1.2.2 抗酸染色實驗法 結核分枝桿菌有抗酸的特性,可保持石炭酸初染的紅色,本實驗染色液購自于珠海貝索生物科技有限公司。取痰液樣本,嚴格按照《痰涂片鏡檢查標準化操作及質量保證手冊》［7］進行樣本處理、涂片、制片和鏡檢,結核分枝桿菌在100×油鏡下呈細長的紅色桿狀。

1.2.3 TB-IGRA 法 以無菌抗凝管采集待測者的靜脈血5 ml,使用TB-IGRA 酶聯免疫分析試劑盒(北京萬泰生物藥業股份有限公司)檢測血液樣本中結核分枝桿菌γ-干擾素的水平,操作和結果判斷嚴格按照說明書進行。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0 統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差()表示,采用t檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同檢測方法對于肺結核疑似患者的檢測結果TB-IGRA 法、實時熒光定量PCR 法的陽性檢出率高于抗酸染色法,差異有統計學意義(χ2=6.400、4.658,P=0.011、0.031<0.05)。TB-IGRA 法、實時熒光定量PCR法的陽性檢出率比較差異無統計學意義(χ2=0.150,P=0.699>0.05)。見表1。

表1 不同方法對疑似肺結核患者的檢出結果比較(n,%)

2.2 不同檢測方法對于結核病診斷的敏感性和特異性比較 病理結果為金標準：60 例疑似患者中,21 例確診為肺結核,39 例確診為其他肺部疾病。TB-IGRA 法、實時熒光定量PCR 敏感性分別為76.19%、85.71%,高于抗酸染色法的42.86%,差異有統計學意義(χ2=4.842、8.400,P=0.028、0.004<0.05)；TB-IGRA 法與實時熒光定量PCR 敏感性比較差異無統計學意義(χ2=0.618,P=0.432>0.05)。實時熒光定量PCR 的特異性為97.44%,與抗酸染色法、TB-IGRA法的100.00%、87.18% 比較,差異無統計學意義(χ2=1.013、2.889,P=0.314、0.089>0.05)。TB-IGRA法的檢測特異性低于抗酸染色法,差異有統計學意義(χ2=5.342,P=0.021<0.05)。見表2。

表2 不同檢測方法對于結核病診斷的敏感性和特異性比較(n,%)

3 討論

世界衛生組織發布的《2018 年全球結核病控制報告》顯示2017 年全球范圍內估計新增1000 萬結核病患者,約130 萬人死于該病,是全球十大死亡原因之一,在單一傳染病中其致死率高于艾滋病等其他疾病。中國2017 年新增結核病患者88.9 萬例,是結核病高危和高負擔國家之一,提高結核病的診斷率,減少耐藥性并提升治療效果,對“終止結核病”的實現至關重要［8］。針對結核分枝桿菌的實施準確便捷的檢測可減少漏診情況,是結核病防控重要且有效的手段,本研究對熒光定量PCR 法、抗酸染色法和IGRAs 法對結核病診斷的價值進行分析。

抗酸染色法是結核分枝桿菌病原學檢測的傳統方法,此方法存在耗時較長,需2～3 d 才可看到檢測結果,對樣本中結核分枝桿菌的數量有一定要求,存在較大的漏診風險,但是其成本低廉、操作簡便、對儀器設備無特殊要求且操作易于掌握等優點在結核病診斷中被廣泛應用［9］。2017 年世界衛生組織推薦使用美國Cephid 公司的Xpert MTB/RIF 試劑盒對結核分枝桿菌進行檢測,該試劑盒能夠同時診斷結核病和檢測利福平耐藥情況,但價格較昂貴,并未廣泛應用于基層［10］。實時熒光定量PCR 法以PCR 技術為基礎,在核酸擴增過程中加入熒光探針進行標記,通過檢測熒光強度評價目的基因的水平,速度快、準確度較高、實用性強,成為發展迅速的分子診斷技術［11］。TB-TGRAs 則通過T 淋巴細胞介導的γ-干擾素免疫反應對患者進行免疫學檢測,是當前對結核桿菌感染進行篩查的重要手段。通過不同的檢測方法對60 例肺結核疑似患者進行檢測,實時熒光定量PCR 法和TB-IGRA 法的陽性檢出率顯著高于抗酸染色法,提示實時熒光定量PCR 和TBIGRA 法在結核分枝桿菌檢測中顯示出更好的效果。

敏感性和特異性是評價檢測方法重要的指標,實時熒光定量PCR 法和TB-IGRA 法的敏感性顯著高于抗酸染色法,和相關文獻報道一致［12］；實時熒光定量PCR 的特異性與抗酸染色法、TB-IGRA 法比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。TB-IGRA 法的檢測特異性低于抗酸染色法,差異有統計學意義(P＜0.05)。提示實時熒光定量PCR 法在結核病診斷中顯示出更好的應用前景。TB-IGRA 檢測陽性表明患者體內存在對結合桿菌感染的免疫反應,并不能確定患者體內結核分枝桿菌的存在情況,對于潛伏期或非活動期的結核病檢測更有優勢。實時熒光定量PCR 檢測中出現1 例假陽性病例,可能與操作過程中出現的非特異性擴增或者樣本污染等因素有關。

綜上所述,實時熒光定量PCR 用于結核病診斷的敏感性和特異性均較高,在結核病的臨床診斷中顯示出較高的臨床應用價值。