八寶丹通過AKT與ERK信號通路抑制乳腺癌4T1細胞增殖

藍兆 何嘉 陳進曉 沃達 馬恩 彭軍 朱偉東 任丹妮

〔摘要〕 目的 探討八寶丹（Babao Dan， BBD）通過AKT與ERK信號通路對小鼠乳腺癌（4T1）細胞增殖的影響。方法 CCK8法檢測不同濃度（0.25、0.5、0.75 mg/mL） BBD干預不同時間點（24、48、72 h）的4T1細胞活力;鏡下觀察無血清對照組、血清組、BBD低劑量組（0.5 mg/mL）、BBD高劑量組（0.75 mg/mL）中4T1細胞的增殖變化;Western blot法檢測10%胎牛血清（FBS）刺激不同時間點（0、5、15、30、60、120 min）后4T1細胞中p-AKT、p-ERK的蛋白表達水平，以確認信號通路激活的最佳時間。與此同時，將4T1細胞隨機分為6組：對照組、模型組、BBD低劑量組、BBD高劑量組、U0126組（10 μmol/L）和LY294002組（20 μmol/L），采用Western blot法檢測p-AKT、p-ERK的蛋白表達水平;最后將對數增長期的4T1細胞隨機分為對照組、BBD組、U0126組（ERK信號通路抑制劑）、LY294002組（AKT信號通路抑制劑）、BBD+U0126組、BBD+LY294002組、U0126+LY294002、BBD+U0126+LY294002組8組，通過臺盼藍染色法檢測以上各組干預24、48、72 h后對4T1細胞增殖的影響。結果 CCK8法結果表明，與對照組相比，不同濃度BBD干預24、48、72 h后細胞活力均顯著下降，差異具有統計學意義（P<0.001）。鏡下觀察可見，與無血清對照組相比，血清組細胞形態飽滿且生長迅速;與血清組相比，BBD低劑量組以及BBD高劑量組細胞生長緩慢。Western blot結果顯示，與0 min比較，10% FBS干預5 min時p-ERK蛋白表達顯著升高（P<0.05），同時30 min p-AKT蛋白表達明顯上調并且均達到峰值（P<0.05）。與對照組相比，模型組p-ERK、p-AKT蛋白表達均顯著上調（P<0.05）;與模型組相比，BBD低劑量組、BBD高劑量組p-ERK、p-AKT蛋白表達均顯著下調（P<0.05），與U0126組和LY294002組抑制效果相當。臺盼藍染色法結果可見，與對照組相比，BBD組、U0126組以及LY294002組均可顯著抑制4T1細胞增殖（P<0.001），其中BBD+U0126+LY294002組與U0126+LY294002組抑制效果相似，均可發揮顯著增殖抑制作用（P<0.001），且24、48、72 h結果一致。結論 BBD可顯著抑制4T1細胞增殖，其機制可能與抑制AKT與ERK信號通路表達有關。

〔關鍵詞〕 八寶丹;乳腺癌;細胞增殖;ERK;AKT;磷酸化

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.009

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of Babao Dan （BBD） on the proliferation of mouse breast cancer 4T1 cells through AKT and ERK signaling pathways. Methods CCK8 assay was used to detect the 4T1 cells viability treated with different concentrations BBD （0， 0.25， 0.5， 0.75 mg/mL） in different time points （24， 48， 72 hours）; the proliferation of 4T1 cells in serum-free control group， serum group， low-dose BBD group （0.5 mg/mL） and high-dose BBD group （0.75 mg/mL） were observed under microscope. Western blot was used to detect the activation of AKT and ERK signaling pathways in 4T1 cells treated with fetal bovine serum at different time points （0， 5， 15， 30， 60， 120 minutes） to confirm the optimal time to activate the signaling pathway. In addition， the cells were divided into 6 groups： control group， model group， BBD low-dose group， BBD high-dose group， U0126 group （10 μmol/L）， LY294002 group （20 μmol/L）， Western blot was used to detect the protein expression of p-AKT， AKT， p-ERK and ERK. Finally， 4T1 cells in logarithmic growth phase were randomly divided into control group， BBD group， U0126 group （ERK signaling pathway inhibitor）， LY294002 group （AKT signaling pathway inhibitor）， BBD + U0126 group， BBD + LY294002 group， U0126 + LY294002 group， BBD + U0126 + LY294002 group， the effects of the above groups on the proliferation of 4T1 cells after 24， 48 and 72 hours of intervention were detected by trypan blue staining. Results CCK8 assay showed that compared with control group， the cell viability was significantly reduced treatment with different concentrations of BBD for 24， 48， 72 hours， the differences were statistically significant （P<0.001）; microscopic observation showed that compared with the serum-free control group， the cells in the serum group were full in shape and grew rapidly， compared with the serum group， the cells in the BBD low-dose group and the BBD high-dose group grew slowly. Western blot showed that， compared with 0 minute， the protein expression of p-ERK was significantly increased at 5 minutes treated with 10% fetal bovine serum （P<0.05）， and the protein expression of p-AKT was significantly increased and reached the peak value at 30 minutes simultaneously （P<0.05）; compared with model group， the protein expression of p-ERK and p-AKT was significantly decreased in BBD low-dose group and BBD high-dose group （P<0.05）， which was equivalent to U0126 group and LY294002 group. Trypan blue staining showed that compared with the control group， BBD group， U0126 group and LY294002 group could significantly inhibit the proliferation of 4T1 cells （P<0.001）， and BBD+U0126+ LY294002 group and U0126+ LY294002 group had similar inhibitory effect， and they could play a significant inhibitory effect on proliferation （P<0.001）， the results were consistent at 24， 48 and 72 hours. Conclusion BBD can inhibit the proliferation of mouse breast cancer cells 4T1， its mechanism may be related to the inhibition of the expression of AKT and ERK signaling pathways.

〔Keywords〕 Babao Dan; breast cancer; cell proliferation; ERK; AKT; phosphorylation

乳腺癌是世界上最常見的女性高發癌癥，疾病呈現快速增長趨勢，多趨于年輕化[1]，發病率在全球范圍逐步攀升，晚期乳腺癌致死率高[2]。惡性腫瘤是在多種病理因素作用之下產生的，主要表現為細胞異常增殖[3]，其中，AKT信號通路是人類癌癥最常見的信號通路之一，調控著細胞異常增殖以及腫瘤發生發展的關鍵環節[4]。在PI3K信號通路中，AKT的磷酸化過程發生在通路上游，能夠活化下游諸多分子，促進乳腺癌的發生發展[5]。此外，ERK 1/2是絲裂原活化蛋白激酶超家族成員，主要介導細胞增殖與分裂，在癌癥研究中已成為重要的干預靶點[6-7]，過往研究[8-10]表明，在乳腺癌發展過程中，抑制ERK的磷酸化可以有效地抑制乳腺癌的增殖和轉移，而且AKT與ERK信號通路在調控腫瘤細胞增殖和轉移方面具有協同作用。中醫學辨證論治惡性腫瘤歷史悠久，有著至關重要的地位，八寶丹作為清熱解毒、活血止痛的典型傳統中藥名方，已被證實在治療胰腺癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤疾病中均能發揮良好療效[11-12]。乳腺癌發病機制復雜，并且八寶丹針對抑制乳腺癌細胞增殖的機制研究尚無報道，故本實驗擬通過體外細胞實驗從AKT與ERK信號通路探討八寶丹抑制乳腺癌細胞增殖的作用機制，以此提供理論基礎與實驗支持。

1 材料與方法

1.1 ?主要試劑

DMEM高糖培養基（批號：SH30022.01）、0.25%胰蛋白酶（Trypsin）（批號：25200072）、胎牛血清（批號：10091148）均購自美國Gibco公司;青霉素和鏈霉素混合液（批號：SV30010）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（批號：SH30256.01B）均購自美國Hyclone公司;八寶丹（廈門中藥廠股份有限公司，生產批號：190530）;ERK1/2（批號：4695S）、Phospho-p44/42 MAPK（ERK1/20）（批號：4370S）、AKT（批號：4691S）均購自美國 Cell Signaling Technology公司;Phspho-AKT抗體（批號：66444-1-Ig）、GAPDH抗體（批號：60004-1-Ig）均購自武漢三鷹生物技術有限公司;SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）（批號：P0286-15 ml）、NP-40裂解液（批號：P0013F）、BCA蛋白定量試劑盒（批號：P0011）、CCK8試劑盒（批號：C0038）均購自上海碧云天生物技術有限公司;PVDF膜（批號：ISEQ00010）、ECL化學發光試劑盒（批號：WBKLS0500）均購自美國Millipore公司;蛋白酶抑制劑（批號：HY-K0010）、磷酸酶抑制劑（批號：HY-K0021）均購自美國MCE公司;二甲基亞砜（DMSO）（批號 A100231-0500）、臺盼藍（批號 C0040-50）均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 ?儀器

CO2培養箱（美國Thermo Fisher公司，型號：3111）;超凈工作臺（蘇州凈化設備公司，型號：SW-CJ-1C）;80 ℃超低溫冰箱（德國Eppendorf公司，型號：F570）;光學倒置顯微鏡（德國Leica儀器有限公司，型號：DM IL LED）;Count Star BioMed全自動細胞計數儀（美國Life公司，型號：IC1000）;酶標儀（德國Tecan公司，型號：Infinite M 200）;小型垂直電泳槽（型號：1658001）、小型轉印轉膜儀（型號：1703930）、超高靈敏化學發光成像儀器（型號：170-8265）均購自美國伯樂公司。

1.3 ?細胞株

小鼠乳腺癌細胞4T1（來源于Dr. FR Miller實驗室）培養于10%胎牛血清和含1%雙抗（青霉素、鏈霉素各100 U/mL）的DMEM高糖培養基中，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。

1.4 ?八寶丹溶液的制備

八寶丹充分溶解于PBS配制成25 mg/mL的藥液，使用超聲儀器助溶1 h，高壓滅菌待藥液徹底混勻后，將藥液分裝于-20 ℃冰箱儲存備用。

1.5 ?CCK8法檢測細胞活力

取對數生長期的4T1細胞以1×104個/mL細胞密度接種于96孔板中，每孔細胞懸液為100 μL，不同藥物濃度均設置6個實驗復孔，待次日細胞貼壁后分別使用濃度0.25、0.5、0.75 mg/mL的BBD藥液進行干預，在藥物干預24、48、72 h后加入CCK8試劑，并于波長為450 nm處檢測吸光度（A值）。

細胞活力=不同BBD濃度組A值/對照組A值×100%

1.6 ?細胞形態觀察

4T1細胞按照2×105個/mL密度接種于35 mm細胞培養皿中，待次日細胞貼壁后，將細胞隨機分為無血清對照組、血清組、BBD低劑量組、BBD高劑量組，共4個組。無血清對照組細胞無血清培養24 h，其余三組均有血清培養24 h后，其中BBD低劑量組加入0.5 mg/mL的BBD，BBD高劑量組則加入0.75 mg/mL的BBD培養24 h，用倒置顯微鏡觀察細胞形態并采集圖像。

1.7 ?Western blot法檢測10%胎牛血清（FBS）、BBD、U0126以及LY294002對4T1細胞中p-AKT、p-ERK蛋白表達的影響

按照“1.6”項方法接種細胞后，采用10% FBS干預不同時間點（0、5、15、30、60、120 min）4T1細胞中p-AKT、p-ERK蛋白表達，以此確認信號通路激活時間點，根據時間點進行后續造模實驗。隨后，另外設置對照組、模型組、BBD低劑量組（0.5 mg/mL）、BBD高劑量組（0.75 mg/mL）、U0126（ERK信號通路抑制劑;使用濃度：10 μmol/L）、LY294002組（AKT信號通路抑制劑;使用濃度：20 μmol/L），當細胞培養密度達60%左右時，各組細胞均饑餓24 h，隨后使用BBD、U0126、LY294002分別干預24 h后，根據胎牛血清激活信號通路的具體時間點刺激，干預結束后統一收集細胞，使用NP40裂解液提取細胞總蛋白，BCA定量法測定蛋白濃度，在各組蛋白樣本均加入1/4體積的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×），在100 ℃金屬浴中變性10 min后，采用SDS-PAGE電泳法進行凝膠電泳，電泳結束后將凝膠上蛋白轉移至0.22 μm PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉封閉2 h后剪裁對應分子量的蛋白指標，對應孵育一抗p-AKT（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、p-ERK（1∶1 000）、ERK（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）均放置于4 ℃冷庫搖床孵育過夜，最后采用辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000）室溫下孵育1 h后，進行蛋白顯影成像分析。

1.8 ?臺盼藍染色法檢測細胞增殖能力

按照“1.6”項方法接種細胞后，將4T1細胞隨機分為對照組（未加入BBD，但加入等體積的PBS）、BBD組（僅加入0.5 mg/mL BBD藥液）、U0126組（僅加入10 μmol/L U0126通路抑制劑）、LY294002組（僅加入20 μmol/L LY294002通路抑制劑）、BBD+U0126組（同時加入0.5 mg/mL BBD以及10 μmol/L U0126通路抑制劑）、BBD+LY294002組（同時加入0.5 mg/mL BBD以及20 μmol/L LY294002通路抑制劑）、U0126+LY294002組（同時加入10 μmol/L U0126通路抑制劑以及20 μmol/L LY294002通路抑制劑）、BBD+U0126+LY294002組（同時加入0.5 mg/mL BBD、10 μmol/L U0126通路抑制劑以及20 μmol/L LY294002通路抑制劑），通過鏡下拍照觀察并記錄細胞生長與形態變化，隨后使用胰酶消化細胞，收集不同組別細胞，加入完全培養基終止消化，重懸并混勻細胞，與0.2 %臺盼藍按照1∶1比例混合打勻后加入計數板孔中，操作全自動細胞計數儀計算活細胞總數。

1.9 ?統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，對各組實驗數據滿足正態分布以及方差齊性時，采用單因素方差分析及LSD檢驗;不滿足正態分布及方差齊性時采用秩和檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ?BBD對4T1細胞活力的影響

與對照組比較，不同濃度（0.25、0.5、0.75 mg/mL）的BBD干預24、48、72 h均能顯著抑制4T1細胞活力（P<0.001），差異有統計學意義。見圖1。

2.2 ?BBD對10% FBS刺激4T1細胞增殖的影響

倒置顯微鏡下觀察可見，與無血清對照組相比，血清組細胞生長迅速;與血清組相比，BBD低劑量組以及 BBD高劑量組細胞生長緩慢。見圖2。

2.3 ?10% FBS對4T1細胞中p-AKT、p-ERK蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，10% FBS干預5 min以及30 min均可顯著上調4T1細胞ERK和AKT磷酸化蛋白表達，且磷酸化蛋白表達均達到峰值，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

2.4 ?BBD、U0126以及LY294002對4T1細胞中p-AKT、p-ERK蛋白表達的影響

與對照組對比，模型組p-ERK和p-AKT可見顯著上調，差異有統計學意義（P<0.05）;然而BBD低劑量、BBD高劑量組p-AKT、p-ERK蛋白表達均可見明顯下調，差異有統計學意義（P<0.05），與U0126組以及LY294002抑制效果相當。見圖4。

2.5 ?BBD與U0126、LY294002對4T1細胞增殖的影響

與對照組比較，BBD組、U0126組以及LY294002組均可顯著抑制4T1細胞增殖，差異有統計學意義（P<0.001），并且BBD+U0126+LY294002組與U0126+LY294002組抑制效果相似，均可發揮顯著增殖抑制作用，差異有統計學意義（P<0.001），且24、48、72 h結果一致。見圖5-7。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，現代醫學主要治療手段為手術治療、內分泌治療、放化療等，臨床表現多為乳痛伴有腫塊，乳頭凹陷呈“橘皮樣變”，并可見溢血等[13]。中醫學中乳腺癌的病名為“乳巖”，從臟腑經絡學說辨證角度認識到情志因素為重要發病誘因，肝郁氣滯、氣郁痰結、經絡不通為主要病機[14]，針對乳巖病因病機特點，宜多采用疏肝解郁、驅邪抗癌、注重調補肝脾的治療原則[15]。現代研究[16]表明，中藥及其成分在抑制乳腺癌的生長增殖、抑制癌細胞遷移等方面發揮抗癌優勢，從而降低腫瘤復發與轉移發生。本研究通過CCK8法結果證實，BBD能夠顯著抑制小鼠乳腺癌細胞4T1的生長，且在24、48、72 h不同時間點的抑制效果確切。

八寶丹作為我國保密傳統名藥復方，主要成分有天然牛黃、蛇膽、羚羊角、珍珠、三七和天然麝香等，由于中藥復方存在多靶點的特點，具體療效是在多個活性成分交互作用之下產生，而非單一成份發揮作用。八寶丹中主要成分麝香辛溫走竄，能活血化瘀、消腫止痛，研究[17]表明麝香酮可阻止新生血管形成從而抑制腫瘤增殖與轉移;羚羊角性寒味咸，具有涼血解毒、解熱鎮靜作用，現代藥理研究[18]證實，其可改善癌性發熱和發揮抗炎作用;三七具有活血化瘀、通脈活絡之功，三七皂苷作為中藥三七有效成分，已有研究[19]證實三七皂苷能顯著抑制乳腺癌細胞增殖、改善腫瘤微環境、提高機體免疫力，從而有效防治乳腺腫瘤疾病;牛黃多主清熱解毒、活血散結，現代醫學認為牛黃具有良好的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，多運用于乳癌、瘡癰腫毒等癥[20]，研究[21]發現牛黃對多種腫瘤均存在治療作用，經典復方西黃丸實驗中發現，伴隨著藥物用量增多，調節性T細胞數量降低，可顯著抑制乳腺癌小鼠細胞增殖生長。諸藥合用共奏清利濕熱、活血解毒之功，驅邪扶正，調整陰陽，對惡性腫瘤疾病有良好治療效果，諸多研究[22-24]結果表明，八寶丹不僅能有效抑制腫瘤細胞增殖遷移，而且能輔助提升化療藥物的敏感性，進一步佐證八寶丹防治惡性腫瘤的療效優勢。

腫瘤的發生發展過程中的生長代謝需要提供大量營養物質，其中生長因子對腫瘤細胞增殖的意義尤其重要，胎牛血清中富含多種生長因子，包括蛋白質、多肽以及激素等成分，其中發揮作用的蛋白質為白蛋白與球蛋白，多肽被認為可能是血清中促細胞增殖的重要因子，具有促進上皮細胞以及成纖維細胞增殖的作用，而激素可以促使細胞大量攝取葡萄糖以及氨基酸，進而實現細胞黏附以及分裂增殖作用[25]。故此我們通過Western blot法證實，FBS能誘導ERK以及AKT的磷酸化，分別于5 min 和30 min激活AKT和ERK信號通路并達到峰值，從而提示信號轉導通路的異常改變在乳腺癌發生發展中也有著重要意義。其中AKT通路通過活化下游諸多分子，可促進乳腺癌疾病的發生發展[26]，而且抑制AKT磷酸化過程能夠對阻斷信號轉導、抑制細胞增殖發揮關鍵作用，研究[27]發現，乳腺癌中檢測到Ser473磷酸化的AKT以及基因擴增與過表達。AKT作為通路核心蛋白，活化的AKT發生磷酸化激活多種下游底物，這一過程在腫瘤發展和細胞惡變中起著重要作用[28]，已有實驗[29]證實固本抑瘤II號方可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路促進凋亡與自噬，從而抑制乳腺癌細胞的生長與增殖。而針對ERK通路的研究，多聚焦于參與調控腫瘤細胞增殖當中[30]，ERK1/2多以非活性形式存在于胞質當中，受到理化因素刺激后磷酸化被活化轉位進入胞核，參與細胞生長發育與分裂等過程，也在細胞增殖、惡性轉化一系列病理變化過程中發揮重要作用[31]。乳腺癌細胞增殖與ERK1/2有著密切的關系[32]，細胞外信號調節激酶一旦被激活，可以磷酸化一系列的胞質蛋白，激活轉錄因子啟動細胞增殖，在乳腺癌等多種癌組織中，ERK1/2的激活可促進腫瘤細胞增殖[33]。相關研究[34]發現全反式維甲酸處理乳腺癌細胞系SKBR-3后，ERK磷酸化水平降低，導致細胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制乳腺癌細胞生長。為了進一步研究BBD通過AKT和ERK信號通路對小鼠乳腺癌細胞4T1增殖的影響，我們通過臺盼藍染色法以及Western blot法證實，BBD能通過抑制AKT和ERK信號通路的激活，從而抑制小鼠乳腺癌細胞4T1增殖。

AKT與ERK信號通路均參與細胞增殖與蛋白質合成，在不同腫瘤疾病中極其活躍，影響下游細胞周期調節蛋白等效應分子活性，在癌癥發生發展中發揮重要意義[35-36]。研究[37-40]證明，在乳腺癌的治療中，兩條途徑的雙重抑制效果顯著優于一條途徑的療效，因此，有效抑制AKT以及ERK信號通路轉導從而抑制乳腺癌細胞增殖對于中醫藥防治乳腺癌具有研究意義，本實驗從AKT與ERK信號通路闡述八寶丹抑制乳腺癌細胞增殖的內在機制，為臨床輔助治療乳腺癌提供實驗基礎與理論依據。由于乳腺癌具有一個多階段、多步驟的發病過程，近年來運用通路分子抑制劑以及中醫藥輔助治療成為熱點，所以仍需要從多層面深入認識發病分子機制，為防治乳腺惡性腫瘤提供新的治療思路與新出路。

參考文獻

[1] SIEGEL R L， MILLER K D， JEMAL A. Cancer statistics[J]. CA： a cancer journal for clinicians. 2020， 70（1）： 7-30.

[2] MATTIUZZI C， LIPPI G. Cancer statistics： A comparison between World Health Organization （WHO） and global burden of disease （GBD）[J]. European Journal of Public Health， 2020， 30（5）： 1026-1027.

[3] 隆 ?霜，沈 ?宜，謝瑩珊，等.乳腺癌MDA-MB-231細胞源Exosomes對內皮細胞增殖的影響及MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路的作用[J].解放軍醫學雜志，2012，37（11）：1054-1058.

[4] DAVIES B R， GREENWOOD H， DUDLEY P， et al. Preclinical pharmacology of AZD5363， an inhibitor of AKT： pharmacodynamics， antitumor activity， and correlation of monotherapy activity with genetic background[J]. Molecular cancer therapeutics. 2012， 11（4）： 873-887.

[5] CIRUELOS GIL E M. Targeting the PI3K/AKT/mTOR pathway in estrogen receptor-positive breast cancer[J]. Cancer Treatment Reviews， 2014， 40（7）： 862-871.

[6] TIWARI A， IIDA M， KOSNOPFEL C， et al. Blocking Y-Box Binding Protein-1 through Simultaneous Targeting of PI3K and MAPK in Triple Negative Breast Cancers[J]. Cancers， 2020， 12（10）： 2795.

[7] HANYU X， LANYUE L， MIAO D， et al. Effect of Ganoderma applanatum polysaccharides on MAPK/ERK pathway affecting autophagy in breast cancer MCF-7 cells[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2020， 146： 353-362.

[8] FRUMAN D A， ROMMEL C. PI3K and cancer： Lessons， challenges and opportunities[J]. Nature Reviews Drug Discovery， 2014， 13（2）： 140-156.

[9] JANKU F， YAP T A， MERIC-BERNSTAM F. Targeting the PI3K pathway in cancer： Are we making headway？[J]. Nature Reviews Clinical Oncology， 2018， 15（5）： 273-291.

[10] KITAGAWA M， LIAO P J， LEE K H， et al. Dual blockade of the lipid kinase PIP4Ks and mitotic pathways leads to cancer-selective lethality[J]. Nature Communications. 2017， 8（1）： 2200.

[11] SONG L B， GAO S， ZHANG A Q， et al. Babaodan Capsule （八寶丹膠囊） combined with Qingyi Huaji Formula （清胰化積方） in advanced pancreatic cancer-a feasibility study[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine， 2017， 23（12）： 937-942.

[12] WANG Q， LIU Z， DU K， et al. Babaodan inhibits cell growth by inducing autophagy through the PI3K/AKT/mTOR pathway and enhances antitumor effects of cisplatin in NSCLC cells[J]. American journal of translational research， 2019， 11（8）： 5272-5283.

[13] 謝 ?霞.乳腺癌的臨床表現及早期篩查方法[J].臨床醫藥文獻電子雜志，2015，2（21）：4347-4348.

[14] 郭艷靜，劉麗芳.中醫中藥治療乳腺癌臨床研究進展[J].中華中醫藥學刊，2012，30（8）：1774-1777.

[15] 楊秋莉，王學芬，張向農.古代中醫對乳腺癌的認識[J].中國中醫基礎醫學雜志，2010，16（5）：437-439.

[16] KANG JX， LIU J， WANG J， et al. The extract of huanglian， a medicinal herb， induces cell growth arrest and apoptosis by upregulation of interferon-beta and TNF-alpha in human breast cancer cells[J]. Carcinogenesis， 2005， 26（11）： 1934-1939.

[17] 劉永惠，常 ?靖，薛陸軍，等.麝香酮對血瘀證乳腺癌生長及對VEGF表達的影響[J].西安交通大學學報（醫學版），2014，35（4）：547-550.

[18] 李偉林，林希倫，戴仁舜，等.聯用羚羊角和抗生素治療癌癥化療患者高熱的臨床觀察[J].中西醫結合實用臨床急救，1996，3（11）：487-488.

[19] 楊 ?松，洪勇.三七總皂苷與乳腺癌治療[J].現代腫瘤醫學，2018，26（9）：1454-1457.

[20] 劉成德，劉 ?洋，旺建偉.牛黃的藥理作用及臨床應用概況[J].中醫藥信息，2006，23（6）：14-15.

[21] 蘇 ?亮.西黃丸調節MEKK1/SEK1/JNK1/AP-1通路減少4T1乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤微環境Treg細胞數量的抗腫瘤作用研究[D].大連：大連大學，2018.

[22] 周 ?忠，王和鳴.八寶丹誘導骨肉瘤細胞U-2OS凋亡及其機制的研究[J].中國中醫骨傷科雜志，2007，15（5）：32-34.

[23] 成 ?瑜，李洪倫.八寶丹處理肺腺癌細胞A549和SPCA-1對順鉑化療敏感性的影響[J].濱州醫學院學報，2016，39（6）：414-417.

[24] 吳 ?皓，李 ?鴻，祁 ?鑫，等.八寶丹對結腸癌荷瘤小鼠的血、脾和骨髓中的髓系抑制性細胞的影響[J].中華中醫藥雜志，2014，29（2）：568-570.

[25] 司徒鎮強，吳軍正.細胞培養[M].4版.西安：興界圖書出版西安公司出版發行，2001：44.

[26] 韋柳婷，馮 ?潔，莫書榮.PI3K-Akt信號通路與腫瘤相關性的研究進展[J].腫瘤學雜志，2014，20（4）：331-336.

[27] L？譫PEZ-KNOWLES E， O'TOOLE S A， MCNEIL C M， et al. PI3K pathway activation in breast cancer is associated with the basal-like phenotype and cancer-specific mortality[J]. International Journal of Cancer， 2010， 126（5）： 1121-1131.

[28] SUN C H， CHANG Y H， PAN C C. Activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway correlates with tumour progression and reduced survival in patients with urothelial carcinoma of the urinary bladder[J]. Histopathology， 2011， 58（7）： 1054-1063.

[29] 馬 ?叢.固本抑瘤Ⅱ號及拆方對乳腺癌MCF-7細胞自噬及PI3K信號通路干預研究[D].北京：北京中醫藥大學，2014.

[30] SAMATAR A A， POULIKAKOS P I. Targeting RAS-ERK signalling in cancer： Promises and challenges[J]. Nature Reviews Drug Discovery， 2014， 13（12）： 928-942.

[31] 汪宏斌.ERK信號轉導途徑與乳腺癌細胞增殖及凋亡的關系[D].承德：承德醫學院，2007.

[32] 吳向華，陸云飛.MAPK信號傳導通路與乳腺癌關系的研究進展[J].廣東醫學，2010，31（4）：526-528.

[33] 張 ?豐，李 ?楠.ERK/MAPK信號傳導途徑在乳腺腫瘤治療中的意義[J].中國腫瘤生物治療雜志，2007，14（5）：497-500.

[34] WANG B， YAN Y， ZHOU J， et al. A novel all-trans retinoid acid derivatives inhibits the migration of breast cancer cell lines MDA-MB-231 via myosin light chain kinase involving p38-MAPK pathway[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2013， 67（5）： 357-362.

[35] CHAMBARD J C， LEFLOCH R， POUYSSéGUR J， et al. ERK implication in cell cycle regulation[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2007， 1773（8）： 1299-1310.

[36] LIANG J Y， SLINGERLAND J M. Multiple roles of the PI3K/PKB （Akt） pathway in cell cycle progression[J]. Cell Cycle， 2003， 2（4）： 339-345.

[37] SHIMIZU T， TOLCHER A W， PAPADOPOULOS K P， et al. The clinical effect of the dual-targeting strategy involving PI3K/AKT/mTOR and RAS/MEK/ERK pathways in patients with advanced cancer[J]. Clinical Cancer Research， 2012， 18（8）： 2316-2325.

[38] MANDAL R， BECKER S， STREBHARDT K. Stamping out RAF and MEK1/2 to inhibit the ERK1/2 pathway： An emerging threat to anticancer therapy[J]. Oncogene， 2016， 35（20）： 2547-2561.

[39] JOKINEN E， LAURILA N， KOIVUNEN J P. Alternative dosing of dual PI3K and MEK inhibition in cancer therapy[J]. BMC Cancer， 2012， 12： 612.

[40] SAINI K S， LOI S， AZAMBUJA E D， et al. Targeting the PI3K/AKT/mTOR and Raf/MEK/ERK pathways in the treatment of breast cancer[J]. Cancer Treatment Reviews， 2013， 39（8）： 935-946.