新型表面麻醉劑的口腔黏膜表面麻醉效果研究

曾 東 牛 嬌 李長義 常 津 牛光良▲

1.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 100039；2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西太原 030001；3.天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院，天津 300070；3.天津大學生命科學學院納米醫(yī)學研究所，天津 300072

口腔表面麻醉劑具有操作簡單、無痛、無損傷、減少患者對疼痛恐懼感和避免注射疼痛等優(yōu)點[1]。但是，目前商品化的表面麻醉劑普遍存在起效慢、作用表淺、麻醉效果不佳等缺點[1-3]，開發(fā)滲透力強、起效快、麻醉效果好的表面麻醉劑一直是眾多研究者不斷探索的熱門研究課題之一[4-6]，尤其以脂質(zhì)體為載體的透皮給藥系統(tǒng)為近年來新的研究方向[2]。

本課題組與天津大學材料學院納米生物技術(shù)研究所共同自主研發(fā)了新型表面麻醉劑-載鹽酸利多卡因葡聚糖基納米高分子脂質(zhì)體（Lidocaine hydrochloride lysine -linoleic acid modified dextran polymeric lipid vesicles，LID-LLD-PLVs），其是以賴氨酸、亞油酸、葡聚糖和膽固醇合成的葡聚糖基納米高分子材料為載體，包載利多卡因（Lidocaine，LID）合成[7]，其各項理化性能良好[7]，并具有優(yōu)越的透皮性能，可有效增加LID的透皮量和滲透深度[8]。本課題組前期豚鼠皮膚刺激性實驗顯示對皮膚無刺激性，MTT 毒性實驗結(jié)果為50、100 μg/ml的LID-LLD-PLVs 細胞毒性為0 級（待發(fā)表）。為了探討LID-LLD-PLVs的口腔黏膜麻醉效果，本研究以家兔下頜前牙唇側(cè)牙齦為給藥部位，通過針刺實驗和頦神經(jīng)動作電位實驗對其進行綜合評價。

1 對象與方法

1.1 實驗對象

1.1.1 材料與試劑

LID-LLD-PLVs、載鹽酸利多卡因傳統(tǒng)脂質(zhì)體（Lidocaine hydrochloride conventional liposomes，LIDCLs），LID 含量2%，天津大學材料學院納米生物技術(shù)研究所實驗室自制；鹽酸利多卡因注射液（Lidocaine hydrochloride injection，LID-IJ），0.1 g/5 ml，批號：201 40312，上海禾豐制藥有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BL-420 生物機能實驗系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司。

1.1.3 實驗動物及分組

新西蘭兔18 只，健康、口頜系統(tǒng)無異常，8 月齡，雌雄、顏色不限，體重（2.0±0.2）kg，購于北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0003，動物質(zhì)量合格證號：11401400000479。常溫普通飼料飼養(yǎng)1 周。本實驗經(jīng)天津醫(yī)科大學藥物實驗倫理委員會批準。將18 只兔按體重分層隨機分組的方法分為陰性對照組、陽性對照組和實驗組，每組6 只。

1.2 實驗方法

1.2.1 牙齦針刺實驗

將兔以仰臥位固定于兔手術(shù)臺，于下頜前牙唇側(cè)牙齦中間劃定約2 mm×5 mm的給藥區(qū)。陰性對照組在給藥區(qū)牙齦涂抹LID-IJ 0.5 ml、陽性對照組在給藥區(qū)牙齦涂抹LID-CLs 0.5 ml、實驗組在給藥區(qū)牙齦涂抹LID-LLD-PLVs 0.5 ml，每5 min 針刺給藥區(qū)牙齦，按上、下、左、右、中順序針刺5 下，兩針刺時距3～5 s，以開頜反射為疼痛指征，記錄疼痛次數(shù)。疼痛≤2 次視為麻醉起效，疼痛≥3 次視為無效。記錄起效時間并計算持續(xù)時間，所有家兔均進行實驗。

1.2.2 頦神經(jīng)動作電位實驗

1.2.2.1 頦神經(jīng)分離 兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦（3 ml/kg）行全麻后取仰臥位，存在睫毛反射，但安靜不動。室溫20℃，于下頜下緣中部內(nèi)側(cè)約1 cm 處剃毛，碘伏消毒，平行下頜骨下緣作口外切口，于骨面剝離軟組織，在頦孔處暴露頦神經(jīng)。鈍性分離，接記錄電極并固定。下頜前牙唇側(cè)牙齦插入刺激電極，在刺激和記錄電極間下頜軟組織內(nèi)插入一針狀電極接地。見圖1。

圖1 頦神經(jīng)的分離

1.2.2.2 初始動作電位記錄 連接BL-420 生物機能實驗系統(tǒng)，執(zhí)行“動作電位引導”實驗?zāi)K。參數(shù)設(shè)置為：調(diào)整刺激強度1 V，波寬1.0 ms，時間常數(shù)0.01 s，高頻濾波5 kHz。

1.2.2.3 給藥后動作電位記錄 給藥方法同“1.2.1”，給藥后每隔5 min 給予1 次電刺激。記錄動作電位幅度（action potential amplitude，APA），計算最大APA 抑制率[ 抑制率（%）=（用藥前APA -用藥后APA）×100 %/用藥前APA]及出現(xiàn)時間。所有兔子均進行實驗。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗，重復測量資料采用重復測量方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組牙齦針刺實驗結(jié)果比較

陰性對照組在給藥后90 min 內(nèi)未出現(xiàn)明顯麻醉效果。實驗組起效時間為（26.67±5.16）min，低于陽性對照組的（40.83±5.85）min，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.449，P ＜0.05）；實驗組麻醉持續(xù)時間為（34.17±3.76）min，與陽性對照組[（29.17±6.65）min]比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=1.604，P ＞0.05）。

2.2 三組家兔頦神經(jīng)APA 抑制率比較

整體分析發(fā)現(xiàn)：組間比較、時間點比較及交互作用差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05），提示三組藥物作用的頦神經(jīng)APA 抑制率存在差異。進一步兩兩比較，組內(nèi)比較：陰性對照組和陽性對照組50 min APA抑制率高于其他時間點，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05），實驗組40 min APA 抑制率高于其他時間點，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；組間比較：實驗組各時間點APA 抑制率高于陽性對照組，陽性對照組50 min內(nèi)APA 抑制率高于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 三組家兔頦神經(jīng)APA 抑制率比較（±s）

表1 三組家兔頦神經(jīng)APA 抑制率比較（±s）

注：與本組10 min 比較，aP ＜0.05；與本組20 min 比較，bP ＜0.05；與本組30 min 比較，cP ＜0.05；與本組40 min 比較，dP ＜0.05；與本組50 min 比較，eP ＜0.05；與本組60 min 比較，fP ＜0.05；與本組70 min 比較，gP ＜0.05；與本組80 min 比較，hP ＜0.05；與陰性對照組比較，*P ＜0.05；與陽性對照組比較，#P ＜0.05。APA：動作電位幅度

3 討論

脂質(zhì)體作為藥物載體的透皮給藥系統(tǒng)已覆蓋很多領(lǐng)域藥物的研究[9-14]。在表面局麻藥的研究中尤以LID 脂質(zhì)體的研究居多，也早已有上市使用，但尚未解決透皮效率低、藥效僅限于皮膚/黏膜表面淺表[15-16]，麻醉難以顯效[17]等難題，部分藥物甚至因此停產(chǎn)。在口腔臨床中，因為現(xiàn)有表面麻醉藥對牙齦、上腭等角化黏膜的穿透力差，所以應(yīng)用更少。

以往關(guān)于口腔局麻藥麻醉效果的研究幾乎全部為人體實驗[18-21]。因為LID-LLD-PLVs 為一新型制劑，尚未達到進行人體實驗條件，只能通過動物實驗來評價其表面麻醉效果。考慮到通過動物的疼痛反應(yīng)來判斷麻醉效果容易出現(xiàn)較大誤差和動物在清醒狀態(tài)下做出的抗拒、掙扎動作會給疼痛反應(yīng)的判定造成干擾，所以本研究選擇針刺實驗和頦神經(jīng)動作電位實驗來綜合評價LID-LLD-PLVs的口腔黏膜表面麻醉效果。

3.1 牙齦針刺實驗

針刺實驗是對局麻藥作用評價常用方法之一，多數(shù)研究者通常采用豚鼠背部針刺實驗法[22]。但LIDLLD-PLVs 是擬用于口腔表面的麻醉藥，作用部位多為牙齦，為角化黏膜，比豚鼠的皮膚敏感性差，為了實驗更有針對性，本研究選擇了家兔的下前牙唇側(cè)牙齦為給藥部位進行針刺實驗。本研究結(jié)果顯示，LID-IJ表面麻醉未顯效，LID-CLs和LID-LLD-PLVs 均具有表面麻醉效果，且以LID-LLD-PLVs 起效更快，持續(xù)時間兩者比較，差異無統(tǒng)計學意義。分析原因可能是LID-LLD-PLVs 滲透速度快于LID-CLs[8]，所以起效更快，但是滲透持續(xù)時間接近一致，所以麻醉效果持續(xù)時間比較無差異。

3.2 LID-LLD-PLVs 對家兔頦神經(jīng)動作電位的影響

國內(nèi)外均有學者使用神經(jīng)電生理實驗方法做局麻藥對牙髓疼痛的鎮(zhèn)痛作用研究[23-25]，實驗動物多為貓、家兔和大鼠，實驗方法多選用記錄二腹肌動作電位或下牙槽神經(jīng)動作電位。關(guān)于表面麻醉藥對牙齦等口腔黏膜鎮(zhèn)痛作用的電生理實驗鮮見報道。家兔下頜前牙唇側(cè)牙齦受頦神經(jīng)支配，頦神經(jīng)為下牙槽神經(jīng)的終末支，選擇記錄頦神經(jīng)動作電位比選擇記錄支配所有下頜牙齒、牙槽骨的下牙槽神經(jīng)動作電位更加定位準確、反應(yīng)靈敏。

頦神經(jīng)動作電位實驗結(jié)果顯示LID-LLD-PLVs對頦神經(jīng)動作電位抑制快、抑制效果強，提示其表面麻醉效果強于LID-CLs和LID-IJ，與針刺實驗結(jié)果一致。LID-IJ 對頦神經(jīng)APA 有輕度抑制作用，但抑制作用較弱，持續(xù)時間具有一過性特點。這點與針刺實驗結(jié)果稍有差異，分析原因可能為LID-IJ表面麻醉效果甚微和動物的掙扎干擾了對疼痛反應(yīng)的判定。

本研究中，兩項實驗結(jié)果均顯示新研制的LIDLLD-PLVs 較LID-CLs和LID-IJ 起效快、麻醉效果好，分析其原因可能為：LID-LLD-PLVs 具有兩親性[7]，更容易透過角質(zhì)層的屏障作用；粒徑小，為納米級，平均粒徑僅為54.1 nm[7]，所以相對于直徑為250 nm的LID-CLs 更容易穿透角質(zhì)層；具有較高的正電位，zeta電位為+27.40[7]，明顯高于LID-CLs（表面電位為+3.76），正電位越高越能更好地改變角質(zhì)層脂類分子的緊密排列[25]，增強其流動性，形成滲透通路，而增加滲透速率；葡聚糖對脂質(zhì)體表面進行修飾，能提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，促進藥物滲透的能力。

新研制的口腔表面局麻藥LID-LLD-PLVs 起效較快，麻醉效果較好，具有良好的作為口腔黏膜表面麻醉劑的臨床應(yīng)用前景。