血清miR-210、miR-218-5p和KIM-1水平對妊娠期高血壓疾病患者腎損傷的診斷價值

居 蕾,曹雨辰,樊莉萍

1.復旦大學附屬婦產科醫院產科，上海 200090；2.上海市第一婦嬰保健院產科，上海 200120

妊娠期高血壓疾病常常發生在妊娠20周左右，以全身小血管痙攣為主要病理生理改變，常引起其他并發癥，其發生率為9.4%～10.4%，病死率達27.5%，對母嬰健康造成嚴重威脅[1-2]。 妊娠期高血壓疾病最早累及的器官為腎臟，因此尋找早期敏感的腎損傷評估指標，對于早期干預和改善妊娠結局具有重要的臨床意義。腎損傷分子(KIM)-1是評價腎損傷的指標，但其診斷腎損傷的效能有限[3]。微小RNA(miRNA)是一類由19～25個核苷酸組成的RNA，在妊娠期高血壓疾病和腎損傷的發生、發展過程中具有重要作用[4]。有研究顯示，miR-210在妊娠期高血壓疾病患者中呈高表達，其水平隨著妊娠期高血壓疾病嚴重程度的增加而明顯升高[5]，但其是否能夠用于評估妊娠期高血壓疾病患者腎損傷情況仍不清楚。還有研究顯示，先兆子癇患者的胎盤中miR-218-5p表達水平明顯降低，miR-218-5p可通過調節血管內絨毛外滋養細胞分化和螺旋動脈重塑，從而阻礙先兆子癇的發生、發展[6]，但miR-218-5p是否對妊娠期高血壓疾病患者腎損傷具有診斷作用仍不清楚。本研究探討了聯合檢測血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1水平對妊娠期高血壓疾病患者腎損傷的診斷效能，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1月至2020年12月復旦大學附屬婦產科醫院診斷為妊娠期高血壓疾病的患者106例為研究組，患者年齡21～40歲，平均(28.97±3.84)歲；體質量指數(BMI)為(22.18±1.23)kg/m2；平均孕周(34.62±1.29)周。選擇同期健康產檢孕婦75例為對照組，年齡22～39歲，平均(28.02±2.94)歲；BMI為(22.32±1.18)kg/m2；平均孕周(34.72±1.22)周。納入標準：妊娠前無高血壓；年齡21～40歲；單胎妊娠；妊娠前無腎損傷。排除標準：合并原發性高血壓、糖尿病和腎病；合并胎盤早剝、先兆流產和前置胎盤；合并免疫性疾病和腫瘤；合并代謝性疾病等。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會審核通過。

1.2診斷標準及分組 根據《妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)》[7]中妊娠期高血壓疾病嚴重程度分類標準，將妊娠期高血壓疾病患者分為妊娠期高血壓組(38例)、輕度子癇前期組(36例)和重度子癇前期組(32例)。妊娠期高血壓診斷標準：妊娠20周后首次出現高血壓，收縮壓(SBP)≥140 mm Hg和(或)舒張壓(DBP)≥90 mm Hg，尿蛋白檢測陰性,在產后12周內血壓恢復正常，即可診斷為妊娠期高血壓。輕度子癇前期診斷標準：妊娠20周達妊娠期高血壓的診斷標準，同時符合下列任何1項，(1)隨機尿蛋白≥0.3 g/24 h或者隨機尿蛋白≥+，或者尿蛋白/肌酐比值≥0.3；(2)雖然無尿蛋白但伴有任何一種器官或者系統(包括心、肝、腎、肺等重要器官或者神經系統、消化系統和血液系統等)受累，即可診斷為輕度子癇前期。重度子癇前期診斷標準：子癇前期患者出現下述任何1項表現，(1)腎功能受損，血肌酐>106 μmol/L；(2)隨機尿蛋白≥2.0 g/24 h或隨機尿蛋白≥++；(3)血液系統異常，血小板<100×109/L，微血管溶血；(4)血清轉氨酶水平升高；(5)持續性頭疼或視覺障礙；(6)血壓持續升高不可控制；(7)SBP≥160 mm Hg和(或)DBP≥110 mm Hg；(8)低蛋白血癥伴胸腔積液、腹水和心包積液；(9)心功能衰竭；(10)肺水腫；(11)胎兒生長受限、胎盤早剝和胎死宮內等，即可診斷為重度子癇前期。根據妊娠期高血壓疾病患者內生肌酐清除率(Ccr)將其分為腎功能正常組(Ccr≥80 mL/min，67例)和腎功能異常組(Ccr<80 mL/min，39例)。

1.3方法

1.3.1血液標本收集 研究組于患者入院后，對照組于產檢時抽取肘靜脈血約5 mL，在室溫下靜置約20 min，然后以3 000 r/min離心10 min，離心半徑為15 cm，取上清液約3 mL，放置在-80 ℃冰箱中保存待測。

1.3.2血清β2微球蛋白(β2-MG)、KIM-1水平檢測 采用全自動生化分析儀(美國Beckman公司)檢測血清β2-MG水平，采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清KIM-1水平。

1.3.3miR-210、miR-218-5p水平檢測 采用TaqMan miRNA試劑盒提取細胞總RNA，采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測血清miR-210和miR-218-5p水平。根據目標基因的mRNA序列設計引物，用Primer Express 3.0軟件設計反轉錄產物為模板，miR-210上游引物：5′-GCTGTGCGTGTGACAGC-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-218-5p上游引物：5′-CGCAGTTGTGCTTGATCT-3′，下游引物：5′-TCCAGTTTTTTTTTTTTTTTACATGGT-3′；GAPDH上游引物：5′- GGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物：5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′。反轉錄后以反轉錄產物為模板，用ABI 7900型RT-qPCR儀(美國ABI公司)進行檢測，反應體系：引物1 μL，cDNA 1 μL，TaqMan GEx MASTER Mix 10 μL，加入雙蒸水將反應體系補充至20 μL。反應條件：85 ℃ 3 min，85 ℃ 20 s，42 ℃ 40 s，循環35次。采用2-ΔΔCt法計算miR-210和miR-218-5p相對表達水平。

1.3.4觀察指標 比較研究組與對照組血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平；比較不同妊娠期高血壓疾病嚴重程度患者血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平；比較不同腎功能患者血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平；評估血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG對妊娠期高血壓疾病患者腎損傷的診斷效能；分析妊娠期高血壓疾病患者血清miR-210、miR-218-5p和KIM-1水平間的相關性。

2 結 果

2.1研究組與對照組血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平比較 研究組血清miR-210、KIM-1和β2-MG水平明顯高于對照組，血清miR-218-5p水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 研究組與對照組血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平比較

2.2不同妊娠期高血壓疾病嚴重程度患者血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平比較 重度子癇前期組血清miR-210、KIM-1和β2-MG水平明顯高于輕度子癇前期組和妊娠期高血壓組，血清miR-218-5p水平明顯低于輕度子癇前期組和妊娠期高血壓組，差異有統計學意義(P<0.05)；輕度子癇前期組血清miR-210、KIM-1和β2-MG水平明顯高于妊娠期高血壓組，血清miR-218-5p水平明顯低于妊娠期高血壓組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同妊娠期高血壓疾病嚴重程度患者血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平比較

2.3不同腎功能患者血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平比較 腎功能異常組血清miR-210、KIM-1和β2-MG水平明顯高于腎功能正常組，血清miR-218-5p水平明顯低于腎功能正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同腎功能患者血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平比較

2.4血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG對妊娠期高血壓疾病患者腎損傷的診斷效能 血清miR-210、miR-218-5p和KIM-1單獨檢測診斷妊娠期高血壓疾病患者腎損傷的曲線下面積(AUC)均高于β2-MG(P<0.05)，因此將miR-210、miR-218-5p、KIM-1用于聯合診斷，根據是否發生腎損傷進行二元Logistic回歸得方程Y=1.32XmiR-210-4.88XmiR-218-5p+0.55XKIM-1-6.87，將其作為聯合檢測指標，聯合檢測的靈敏度為84.6%，特異度為95.5%，AUC為0.957，其AUC明顯優于miR-210、miR-218-5p和KIM-1單獨檢測(P<0.05)。見表4和圖1。

表4 血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG對妊娠期高血壓疾病患者腎損傷的診斷效能

圖1 血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG診斷妊娠期高血壓疾病患者腎損傷的ROC曲線

2.5妊娠期高血壓疾病患者血清miR-210、miR-218-5p和KIM-1水平間的相關性分析 妊娠期高血壓疾病患者血清miR-210和KIM-1水平與miR-218-5p水平均呈負相關(r=-0.555、-0.542，P<0.05)，而血清miR-210與KIM-1水平呈正相關(r=0.575，P<0.05)。

3 討 論

妊娠期高血壓疾病患者主要表現為血壓升高、頭痛頭暈、抽搐、水腫和蛋白尿，部分患者甚至出現昏迷，其導致的腎臟部位小動脈硬化可以直接引起腎損傷，危及母嬰健康[8]。腎損傷常規評估指標是血清尿素氮和肌酐，但只有當腎小球濾過率下降到50%以下時這些指標才會出現明顯升高。β2-MG是由免疫細胞產生的糖蛋白，在腎功能正常的情況下其經腎小球濾過后幾乎被腎小管全部重吸收，血液和尿液中含量很少，其也常常被用于腎損傷的評估[9]。本研究顯示，血清miR-210、miR-218-5p和KIM-1單獨檢測診斷妊娠期高血壓疾病患者腎損傷的效能明顯優于β2-MG，說明miR-210、miR-218-5p和KIM-1具有更高的診斷價值，故本研究進一步將miR-210、miR-218-5p和KIM-1聯合用于妊娠期高血壓疾病患者腎損傷的診斷，結果顯示，聯合檢測的AUC為0.957，明顯高于各項指標單獨檢測，具有較高的臨床推廣應用價值。

本研究中，研究組血清KIM-1水平明顯高于對照組，并且隨著妊娠期高血壓疾病嚴重程度的增加，血清KIM-1水平逐漸升高，提示血清KIM-1與妊娠期高血壓疾病的發生、發展有關，與文獻報道的結論一致[10]。KIM-1是一種Ⅰ型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族黏附分子成員，KIM-1細胞外結構被金屬蛋白酶切割后形成可溶性的KIM-1，并釋放到血液和尿液中。腎功能正常的患者血清KIM-1水平極低甚至不表達，而在腎小管受損的患者中KIM-1水平明顯升高[11]。本研究顯示，腎功能異常組血清KIM-1水平明顯高于腎功能正常組，且當血清KIM-1取截斷值為8.74 ng/mL時，其診斷妊娠期高血壓疾病患者腎損傷的靈敏度為82.1%，特異度為76.1%，AUC為0.825，具有較高的診斷價值，與文獻報道的結果相近[12]。KIM-1能夠引起腎血流量下降和腎小球濾過率降低，是早期腎小管損傷的重要標志物之一，因此其水平變化對于腎損傷的診斷具有重要的臨床意義。

研究表明，miRNA參與了妊娠期高血壓疾病的發生、發展過程，采用基因芯片技術檢測發現，妊娠期高血壓疾病患者出現多種miRNA表達異常[13]。本研究顯示，研究組血清miR-210水平明顯高于對照組，并且隨著妊娠期高血壓疾病嚴重程度的增加血清miR-210水平也逐漸升高，說明miR-210參與了妊娠期高血壓疾病的發生、發展過程，與文獻報道一致[14]。miR-210在機體缺氧環境中呈高表達，組織缺氧越嚴重其表達水平越高，在妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中存在不同程度的缺氧，因此miR-210可以作為胎盤組織缺氧嚴重程度的評估指標[15-16]。當血清miR-210取截斷值為5.77時，其診斷妊娠期高血壓疾病患者腎損傷的靈敏度為74.4%，特異度為89.6%，AUC為0.887，具有較高的診斷效能。本研究中，研究組血清miR-218-5p水平明顯低于對照組，并且隨著妊娠期高血壓疾病嚴重程度的增加，血清miR-218-5p水平逐漸降低。子癇前期的發病機制較為復雜，一般認為是胎盤和母體之間的相互作用導致的，侵襲性絨毛外滋養細胞的破壞作用是子癇前期的重要促成因素，表現為胎盤組織中的絨毛外滋養細胞浸潤，血管絨毛外滋養細胞分化障礙，母體螺旋動脈重塑不足，最終發展為子癇前期[17]。現有研究顯示，miR-218-5p能誘導滋養層侵襲，促進絨毛外滋養細胞向血管內絨毛外滋養細胞分化，加速螺旋動脈重塑[18]。子癇前期患者由于miR-218-5p表達水平降低，導致絨毛外滋養細胞分化受限，抑制了螺旋動脈重塑。本研究還發現，血清miR-218-5p取截斷值為1.22時，診斷妊娠期高血壓疾病患者腎損傷的靈敏度為82.1%，特異度為71.6%，AUC為0.803，具有較高的診斷價值。

相關性分析發現，妊娠期高血壓疾病患者血清miR-210和KIM-1水平與miR-218-5p水平均呈負相關(P<0.05)，血清miR-210水平與KIM-1水平呈正相關(P<0.05)，各指標水平間具有相關性的具體機制仍需要進一步研究。

綜上所述，血清miR-210、miR-218-5p和KIM-1水平與妊娠期高血壓疾病的發生、發展有關，且對患者腎損傷具有較高的診斷價值，聯合檢測的診斷價值優于各指標單獨檢測。