持續牽張應力誘導肌腱干細胞向成骨細胞分化的作用機制研究

沈家亮，王琳，尚文強

(華北醫療健康集團峰峰總醫院骨科，河北 邯鄲 056201)

肌腱損傷是臨床上常見的一種損傷，表現為肌腱的退行性改變，包括脂質沉積、蛋白糖積累和鈣化等[1]。肌腱的組織結構復雜，其主要作用是將肌肉收縮轉化為關節運動，將力量從肌肉傳遞到骨骼[2]。盡管經過多年的廣泛研究，損傷后肌腱結構和功能的恢復仍然是骨科手術和運動醫學中最大的挑戰之一。大量研究已經在鼠類、兔及人類中發現一個新的肌腱細胞群，稱為肌腱干細胞(tendon stem cells，TSCs)。TSCs作為一種成熟的干細胞，能夠自我更新，并且在不同條件下可分化為肌腱細胞和非肌腱細胞(骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞)[3]。同其他肌腱細胞一樣，TSCs也能對施加在肌腱上的各種機械載荷做出反應。并且有研究證實，持續溫和牽張應力刺激對體內肌腱修復可以起到顯著地促進作用[4]。因此，施加牽張力刺激對于TSCs的作用及其在肌腱損傷治療中的應用受到廣泛關注，且隨著相關研究的不斷深入及干細胞治療的興起，均為肌腱病發病機制和治療的研究提供了新思路和新方向。肌腱干細胞治療肌腱損傷的機制：因為干細胞具有潛在的分化能力，而TSCs定向分化為成骨細胞能夠對肌腱損傷的治療起到較大地促進作用。因此，本研究通過對TSCs施加不同強度、持續與間斷的牽張刺激來觀察其對TSCs肌腱分化影響，為TSCs在肌腱損傷治療中的應用提供基礎數據及理論支撐。

1 資料與方法

1.1 大鼠肌腱干細胞的分離與培養 本研究取清潔級雄性8周齡SD大鼠10只，體重在150～200 g(購于北京維通利華實驗動物技術有限公司)。在光照/黑暗為各12 h的恒溫環境及自由進食飲水下適應性飼養1周，腹腔麻醉后進行原代肌腱干細胞的分離及培養[5]。所有細胞傳代至3代后開展后續實驗。

1.2 儀器與試劑 CO2培養箱(Sigma，美國)，流式細胞儀(Muse，德國)，7500Fast聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)儀(Thermo，美國)，Flexcell FX5000 Tension system(Flexcell，美國)，倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本)，酶標儀(Molecular Device，美國)，低速離心機(Thermo，美國)，穩壓電源(伯樂，美國)，DMEM-F12(Dulbecco's modified eagle media-nutrient mixture F-12)培養液(Hyclone，中國)，胎牛血清(Gicbo，澳洲)，青霉素和鏈霉素雙抗混合液(碧云天，中國)，胰蛋白酶(Taraka，中國)，細胞計數試劑(cell counting kit-8，CCK-8)(同仁，日本)，cDNA逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒(TaKaRa，中國)，Trizol(BBI，中國)，SOX2一抗、OCT4一抗(CST，德國)，Runt相關轉錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)一抗(Santa，美國)，增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色液(諾唯贊，中國)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)檢測試劑盒(碧云天，中國)。

1.3 方法

1.3.1 TSCs培養與處理 切除跟腱組織時避免殘留周圍軟組織和腱鞘組織。將取下的肌腱組織稱重，并剪碎成小塊。每100 mg組織加入1 mL Ⅰ型膠原酶和中性蛋白酶后置于37℃培養箱中消化1 h，將消化液與組織碎塊充分混勻。消化結束時加入1 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)吹打混勻。之后將混懸液在1 500 g/10 min條件下離心，倒掉上清液，使用含20%胎牛血清的細胞培養基進行吹打混勻，然后將細胞培養基混合液移入培養瓶中，加細胞培養基至10 mL，放入含5% CO2的37℃培養箱中培養。傳至3代后應用Flexcell FX5000 Tension system進行牽張力處理，參考儀器說明書，將培養的細胞置入處理培養孔內，通過調節設置施加不同牽張力。根據不同牽張力設置四組[0(對照組)、2% Strain、4% Strain、6% Strain)]處理48h進行相關指標檢測。

1.3.2 TSCs鑒定 本研究通過對表面標記物進行流式細胞儀分析方法進行干細胞鑒定，收集約1×107個3代細胞，1 500 r/min離心5 min后棄上清；Buffer液進行重懸，最后取100 mL細胞懸液加入1.5m LEP管內，按量加入CD90、CD44、CD34、CD106一抗后避光孵育30min，相同的離心條件離心后[5-6]，加入300 mL Buffer進行細胞重懸，進樣檢測。

1.3.3 TSCs細胞活力檢測 以2×107個/mL接種到Flexcell FX5000 Tension system專用6孔板后處理48h后，以CCK-8法檢測細胞活力。每孔中加入相應體積的溶液，混勻后在37℃、5% CO2培養箱內繼續培養3h，之后于酶標儀450nm波長處測吸光度(optical density，OD)值。計算細胞相對活力=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%，并進行3次獨立重復實驗。

1.3.4 mRNA表達情況檢測 運用Trziol對各處理組進行總RNA提取后，根據逆轉錄試劑盒反應說明進行cDNA合成。用SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒于Applied Biosystems 7500 Fast PCR儀上進行逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測。檢測干細胞多能性基因SOX2、OCT4的相對表達量及成骨基因RUNX2、DLX5及COL1a的相對表達量。引物均由上海生工生物進行合成，β-action為內參基因，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.3.5 免疫印跡(Western-blot，WB)法對相關蛋白表達進行檢測 按照蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，用WB法測定β-actin(內參)、OCT4、SOX2、RUNX2蛋白表達情況。

b ALP染色細胞活性

1.4 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色 本研究在牽張力處理后，采用ALP試劑盒(索萊寶，中國)進行各組細胞染色。所有染色步驟均按照試劑盒操作進行，采用ALP活性進行數據統計分析。

a 干細胞克隆樣生長 b 鵝卵石樣排列

2 結 果

2.1 TSCs鏡下大體形態及細胞鑒定 原代提取大鼠TSCs進行培養第5天時，有部分細胞已經開始貼壁，形態較為清晰，但沒有聚集生長成為克隆樣，細胞生長較為緩慢。但繼續培養至10 d時，細胞生長速度加快，細胞成鵝卵石樣的排列在瓶底，并且在培養瓶中可見克隆集落形成(見圖1)。

流式細胞術對TSCs細胞表面抗原鑒定的結果進一步顯示大鼠跟腱來源的TSCs具有明確的干細胞特性。超過(97.32±4.58)%和(90.13±5.27)%的細胞干細胞表面標記物CD90、CD44呈陽性表達，而CD34(0.37±0.09)%、CD106(0.58±0.14)%的表達很低，呈陰性(見圖2)。

圖2 TSCs細胞表面標記物流式細胞檢測情況

2.2 不同牽張力處理TSCs后細胞相對活力情況 通過CCK-8法檢測后，各牽張力處理組均出現細胞相對活力呈上升的趨勢，但僅在牽張力為6% Strain時的細胞活力與對照組比較有統計學差異(P<0.05)，而其余各組的升高并沒有統計學意義(P>0.05，見圖3)。

注：*與對照組比較，P<0.05

2.3 不同牽張力處理TSCs后對干性維持基因及蛋白的影響 與對照組相比，2% Strian牽張力組的TSCs細胞SOX2基因表達開始出現下降，但結果沒有統計學差異(P>0.05)，當牽張力達到4% Strain后，SOX2基因表達出現明顯下降(P<0.05，見圖4)。對于OCT4基因，在6% Strain牽張力處理后其表達出現明顯下降(P<0.05，見圖4)。

與對照組相比，6% Strain組OCT4、SOX2蛋白表達量均明顯低于對照組(P<0.05)，在4% Strain組時兩者的相對表達量有所降低，但無統計學意義(P>0.05)，其他牽張力處理組變化也不明顯(見圖5)。

2.4 不同牽張力處理TSCs后對成骨基因及蛋白的影響 與對照組相比，RUNX2基因在各組均有不同程度升高的現象，但僅2% Strain組和6% Strain組升高具有統計學意義(P<0.05)。DLX5基因各組均有升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。而在COL1a僅在6% Strain組升高具有統計學意義(P<0.05，見圖6)。

注：*與對照組SOX2比較，P<0.05；**與對照組OCT4比較，P<0.05

注：*與對照組SOX2比較，P<0.05；**與對照組OCT4比較，P<0.05

注：*與對照組RUNX2比較，P<0.05；**與對照組COL1a比較，P<0.05

本研究對處理48h后的TSCs的RUNX2生成量進行驗證，與對照組比較，在2% Strain和4% Strain組其生成量均有升高，但結果無統計學意義(P>0.05)，僅在6% Strain組顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05，見圖7)。

注：*與對照組比較，P<0.05

a ALP染色結果(ALP染色，×200)

2.5 不同牽張力處理TSCs后對成骨染色的影響 為進一步探討牽張力對TSCs成骨的影響，我們通過ALP染色進行鑒定。與對照組比較，ALP染色活性在牽張力為4%和6%時出現顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05，見圖8)。

3 討 論

肌腱損傷是臨床上常見的一種損傷，修復后常常發生肌腱黏連或關節僵硬導致嚴重的功能障礙，尤其對于肌腱缺損的患者采用自體或異體肌腱移植后黏連更加明顯，因此對肌腱損傷及肌腱缺損的治療，多年來一直是骨科的一大難題[7]。由于肌腱將肌肉力量傳遞到骨骼以使身體運動而起著至關重要的作用，因此它們經常承受機械載荷。由于肌腱是生物組織，其通過改變其新陳代謝來響應機械負荷，并且隨著時間的流逝，這種機械生物學反應會導致其結構和機械特性發生變化[8-12]。因此，了解TSCs如何對機械負荷做出反應非常有意義。

有研究顯示，適度的牽張力刺激有助于TSCs的分化，并可增強TSCs向成骨細胞分化[13]。而Wang等[4]的研究也證明持續溫和牽張應力刺激可顯著促進體內肌腱的修復。成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質的合成、分泌和礦化。人類及動物體骨組織不斷地進行著重建，骨重建過程包括骨的分解吸收與新骨的形成[14]。因此，了解TSCs如何對機械負荷做出反應非常有意義。深入探討適度的牽張力作用TSCs對肌腱損傷的治療及恢復至關重要。

本研究成功從大鼠跟腱組織中提取及分離出TSCs，流式細胞術結果顯示所提TSCs質量及純度相對較高，符合開展深入研究的前提條件。通過CCK-8對不同牽張力作用于TSCs后對細胞相對活力的影響結果分析，各處理組均有增高的趨勢，但僅當牽張力為6% Strain時增高具有統計學意義(P<0.05)。這一部分結果顯示，適度溫和的牽張力作用有助于TSCs的生長，因此有益于肌腱損傷的治療。

在對干性維持基因的研究中發現，SOX2基因在4% Strain時出現下降，且SOX2蛋白在6% Strain處理組下降具有統計學意義(P<0.05)。而OCT4基因僅在6% Strain處理組下降具有統計學意義(P<0.05)，但蛋白并沒有出現顯著變化。這結果同前期部分研究相一致[15]。SOX2和OCT4的表達水平能夠對TSCs多能性的維持產生直接影響[16]。OCT4和SOX2既能維持細胞的自我更新，同時又能抑制分化基因的表達，維持TSCs的多能性，如果其表達量降低，TSCs則會趨于分化生長[17]。因此，本研究可以看出適度的牽張力可以加速誘導TSCs的分化進程，而其加速分化能夠有效縮短肌腱損傷患者的康復時間[3]。

本研究在驗證溫和的牽張力能夠誘導TSCs分化后進一步對其向成骨細胞分化進行探討。選擇三種重要的成骨基因RUNX2、DLX5及COL1a進行檢測[18]。結果顯示，RUNX2基因在各組均有不同程度升高的現象，但僅2% Strain組和6% Strain組升高有統計學意義(P<0.05)。而在COL1a僅在6% Strain組升高有統計學意義(P<0.05)。因此，本研究進一步對RUNX2蛋白進行檢測發現在6% Strain組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。這一結果同我國學者劉祥舟等[19]的研究相同，其通過8% Strain處理后發現成骨基因的RUNX2基因及蛋白表達水平均出現顯著增高。此外有國外學者也對該強度能夠增加RUNX2表達量進行了報道[20]。本研究在低于前人研究的基礎上進一步對其進行佐證。在成骨細胞中，RUNX2能促進早期分化，能促進軟骨細胞成熟和血管侵入軟骨，并且抑制脂肪細胞的形成，其下游的IHH基因是重要的軟骨形成調節因子[21]。此外，我們通過ALP染色進一步驗證了其對成骨分化的誘導作用。因此，RUNX2在肌腱損傷康復中扮演著重要角色。

綜上所述，本研究結果發現，適度溫和的牽張力有助于TSCs的細胞增殖，并且通過尋找適度的牽張力大小可以加速誘導TSCs的分化并具有加速其向成骨細胞分化的能力。因此，未來的肌腱損傷治療中，我們可以選擇適度溫和的牽張作用治療肌腱損傷患者，有助于肌腱病的治療及康復。