上皮性卵巢癌組織中microRNA-375、ERBB2的表達及與臨床病理特征和預后的關系*

劉陽，熊苗，趙立東

（上海交通大學附屬第六人民醫院1.婦產科，2.急診科，上海201306）

卵巢癌是常見的女性生殖系統惡性腫瘤，其發病率在生殖系統惡性腫瘤中位居第3 位，僅次于子宮頸癌和子宮體癌，但其病死率卻位居第1 位，對女性的生命構成巨大威脅[1]。卵巢癌的病理類型多樣，其中以上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）最常見，約占90%[2]。EOC 的早期臨床表現并不顯著，明確診斷較困難，確診時多已轉移至子宮、對側附件或其他腹盆腔器官，對患者預后造成不利影響。因此，深化對EOC 發病機制的掌握是評估其預后和找尋治療靶點的關鍵。microRNA 是由RNA 聚合酶Ⅱ和核糖核酸酶Ⅲ加工處理合成的非編碼RNA，長約22 個堿基，對轉錄激活、染色質沉默及基因組印記等過程具有重要的調控作用[3]。microRNA-375（miR-375）定位于2q35 上，存在于編碼基因Ccdcl08和Cryba2之間，參與調控腫瘤細胞的增殖和凋亡，在乳腺癌、食管癌及肝癌中均呈現異常表達[3-5]。研究表明[6]，在肝癌組織中，miR-375 能夠結合原癌基因Yes相關蛋白1（YAP1），并抑制其表達，從而阻遏癌細胞增殖、侵襲。Erb-b2 受體酪氨酸激酶2（ERBB2）屬于人表皮生長因子受體家族，位于人類染色體17q12，具有酪氨酸激酶活性[7]。ERBB2作為一種原癌基因，能夠編碼跨膜酪氨酸激酶受體蛋白，對腫瘤新生血管、腫瘤細胞分化和轉移具有重要的調控作用[7]。目前，miR-375 和ERBB2 在EOC 中鮮有研究，且兩者均能作用于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/絲氨酸激酶（Akt）信號通路[8-9]。因此，本研究旨在探索EOC 組織中miR-375、ERBB2 的表達及與臨床病理特征和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年10月—2017年10月上海交通大學附屬第六人民醫院收治的134 例EOC 患者基本資料及組織標本。納入標準：①符合《FIGO 2015 婦癌報告解讀》[10]中EOC 的診斷標準，且術后病理證實為EOC；②EOC 患者的一般資料均完整，能夠配合本次研究，且保證定時接受隨訪；③既往無卵巢、子宮手術史或放化療史。排除標準：①合并子宮內膜異位癥、巨大子宮肌瘤或多囊卵巢綜合征等嚴重子宮附件疾病者；②合并其他原發惡性腫瘤者（如胃癌、乳腺癌）；③身體情況較差而不能耐受手術治療者；④肝、腎功能失代償者；⑤嚴重免疫功能缺陷者。采用電話及門診復查的形式對患者進行3年隨訪，截止時間為死亡或隨訪結束。

1.2 方法

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測miR-375 和ERBB2 的表達。手術切除后，立即采集EOC 組織及相應的癌旁組織（距腫瘤邊緣5 cm處）置于液氮中暫存，術后移至-80℃冰箱冷凍保存。標本組織各取100 mg，于冰上充分研磨，滴入1 ml Trizol 試劑（Invitrogen 公司）提取總RNA。將10 μg 總RNA 通過One Step PrimeScript cDNA Synthesis Kit（大連寶生物有限公司）逆轉錄為cDNA。使用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit 試劑盒（大連寶生物有限公司）定量檢測miR-375和ERBB2的表達。PCR反應體系：SYBR PrimeScriptTMRT-PCR5 μl，正向引物0.4 μl，反向引物0.4 μl，cDNA Template 1.0 μl 及dH2O 3.2 μl，共計10 μl。引物序列：miR-375正向5'-GTGCAGGGTCC GAGGT-3'，反 向5'-AGCCGTTTGTTCGTTCGGCT-3'；內參基因U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；ERBB2正向5'-CCAGCCTTCGACAACCTCTATT-3'，反向5'-TGCCGTA GGTGTCCCTTTG-3'；內參基因GAPDH正向5'-ACAA CTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，反向5'-GCCATCACGC CACAGTTTC-3'。miR-375 和ERBB2 的PCR 反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個循環，每個樣本設置3 個復孔。引物由北京諾博萊德科技有限公司合成。通過相對Ct 值計算miR-375 和ERBB2 mRNA 相對表達量，結果以?Ct 值表示，相對于U6或GAPDH的比值為2-ΔΔCt，其中?Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析或t檢驗；相關性分析用Pearson 法。預后影響因素的分析用多因素Cox 逐步回歸模型；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組miR-375 mRNA和ERBB2 mRNA相對表達量的比較

EOC 組織中miR-375 mRNA 相對表達量為（0.73±0.21），較癌旁正常組織（1.49±0.45）低（t=6.818，P=0.000）；而ERBB2 mRNA相對表達量（1.97±0.56）較癌旁正常組織（1.03±0.32）高（t=17.128，P=0.000）。

2.2 EOC 組織中miR-375 mRNA 和ERBB2 mRNA 相對表達量與臨床病理特征的關系

不同淋巴結轉移和FIGO 分期患者EOC 組織中miR-375 mRNA 和ERBB2 mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05），而不同年齡、腫瘤大小、分化程度及病理類型患者EOC 組織中miR-375 mRNA 和ERBB2 mRNA 相對表達量比較，，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征miR-375 mRNA和ERBB2 mRNA相對表達量的比較（±s）

表1 不同臨床病理特征miR-375 mRNA和ERBB2 mRNA相對表達量的比較（±s）

臨床病理特征年齡≥60歲<60歲腫瘤大小>3 cm≤3 cm分化程度高分化中分化低分化淋巴結轉移n miR-375 mRNA t/F 值P 值ERBB2 mRNA t/F 值P 值73 61 0.71±0.15 0.75±0.21 1.246 0.216 1.99±0.62 1.95±0.74 0.341 0.734 100 34 0.71±0.22 0.79±0.35 1.251 0.218 1.98±0.57 1.94±0.53 0.360 0.720 50 71 13 0.77±0.21 0.71±0.27 0.69±0.23 1.071 0.346 1.93±0.47 1.99±0.52 2.01±0.59 0.249 0.780有 無10 124 0.25±0.11 0.77±0.32 11.525 0.000 2.59±0.81 1.92±0.73 2.770 0.006病理類型漿液性癌黏液性癌其他類型癌FIGO分期Ⅰ、ⅡⅢ、Ⅳ53 69 12 0.69±0.21 0.76±0.20 0.73±0.19 1.778 0.173 1.95±0.52 1.99±0.42 1.94±0.45 0.138 0.871 122 12 0.78±0.31 0.21±0.09 14.904 0.000 1.90±0.59 2.68±0.55 4.394 0.000

2.3 EOC組織中miR-375與ERBB2的相關性

經Pearson 相關性分析，結果表明，EOC 組織中miR-375的表達與ERBB2的表達呈負相關（r=-0.598，P<0.05）。見圖1。

圖1 miR-375與ERBB2的相關性散點圖

2.4 EOC 組織中miR-375 和ERBB2 與患者預后的關系

以EOC 組織中miR-375 mRNA 相對表達量的中位數0.73 為臨界值，分為高表達組71 例，低表達組63例。高表達組的3年總生存率為77.46%（55/71），低表達組的3年總生存率為53.97%（34/63），兩組總生存率比較，差異有統計學意義（χ2=4.001，P=0.045），miR-375 低表達組的3年總生存率較高表達組低。以EOC 組織中ERBB2 mRNA 相對表達量的中位數1.97 為臨界值，分為高表達組69 例，低表達組65 例。高表達組的3年總生存率為53.62%（37/69），低表達組的3年總生存率為80.00%（52/65），兩組總生存率比較，差異有統計學意義（χ2=4.289，P=0.038），ERBB2 高表達組的3年總生存率較低表達組低。見圖2。

圖2 不同miR-375和ERBB2表達的EOC患者的生存曲線圖

2.5 EOC患者預后的影響因素

建立Cox比例風險回歸模型，以EOC患者預后情況為因變量，賦值1=死亡，0=生存，t=生存期。以FIGO 分期、淋巴結轉移、miR-375、ERBB2 為自變量。回歸過程采用逐步后退法，以進行自變量的選擇和剔除，設定α剔除=0.10，α入選=0.05。回歸結果顯示，高級別的FIGO 分期[=1.844（95% CI：1.136，2.993）]、有淋巴結轉移[=2.065（95% CI：1.133，3.761）]、miR-375 低表達[=2.162（95% CI：1.051，4.447）]以及ERBB2 高表達[=2.246（95%CI：1.428，3.532）]是影響EOC 患者預后的危險因素（P<0.05）。見表2。

表2 EOC患者預后影響因素的Cox逐步回歸模型參數

3 討論

EOC是最常見的卵巢癌類型，起源于卵巢組織的原始體腔上皮，在一定條件下能夠分化為各種苗勒上皮，進而形成多種組織類型，因此具有較強的異質性[11]。循證醫學調查發現[1]，全世界每年新增卵巢癌病例約24 萬，因卵巢癌死亡的病例數量約為15 萬。我國由于老齡人口比例逐步增加，從而導致卵巢癌的發病率呈逐年上升趨勢。EOC 發生的機制復雜多樣，主要是多基因和多步驟協同作用的結果，細胞間的信號轉導、細胞存活與凋亡的失衡及細胞異常增殖等在EOC 的演化過程中均發揮作用[11]。目前，血清CA125是檢測EOC 常用的血清指標，然而一些卵巢良性病變、胰腺疾病及其他婦科疾病，血清CA125 也會升高，其特異性并不明顯，容易造成過度診斷[2]。手術切除是目前能夠治愈EOC 的唯一方法，但由于EOC 產生的腹水含有大量癌細胞，因此，EOC 的復發率較高，患者的死亡風險增加。表觀遺傳學、基因組學及生物分子學是目前癌癥領域的熱點話題，在評估病情進展程度、輔助診斷或預測復發等臨床實踐中具有重要意義。既往研究表明[4，12]，DNA 拷貝數改變、LncRNA 及DNA甲基化等能夠參與調控腫瘤細胞分裂分化，且具有改變腫瘤微環境的作用，增加正常細胞癌變的風險。

miRNA 盡管不能直接編碼蛋白質，但能夠使沉默復合物與信使RNA 的3'-UTR 靶向結合，使信使RNA 不能完成轉錄后翻譯。miR-375 首次在胰島B細胞中被發現，參與胰島的形成，對胰島素的分泌具有重要的調控作用，但隨著研究的不斷深入，miR-375 被發現能夠調控細胞異常增殖及分化，對腫瘤的形成具有重要影響[3]。KONG 等[12]發現，在體外細胞克隆實驗中，miR-375 通過結合胰島素樣生長因子l（IGF-1）受體抑制食管癌細胞的增殖，發揮抑癌基因的作用。DING 等[13]研究發現，miR-375 能夠靶向結合Janus 激酶2（JAK2），使其表達受阻，從而減緩胃癌細胞的增殖速度。本研究結果表明，EOC 組織中miR-375 mRNA 相對表達量較癌旁組織降低，提示miR-375 在EOC 中發揮一定作用。其機制可能為癌組織中miR-375 發生甲基化，抑制啟動子表達，導致miR-375 轉錄受阻，因此，EOC 組織中的miR-375 表達下調[13]。本研究結果表明，不同FIGO 分期和淋巴結轉移患者的miR-375 mRNA 相對表達量比較差異有統計學意義，提示miR-375 可能參與了EOC 的癌變過程。其原因可能為miR-375 表達下調后使其下游靶點的3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）活化，從而激活PI3K/Akt 信號通路，使細胞糖酵解能力增強，促進癌細胞迅速增殖分化[8，14]。此外，miR-375表達受阻能夠激活致癌基因YWHAZ，導致各種凋亡蛋白失活，使癌細胞能夠進行無限有絲分裂，同時，活化的YWHAZ 能夠誘導上皮間質轉化，從而促進癌細胞轉移和侵襲[15]。

ERBB2是一種轉化基因，屬于表皮生長因子受體家族，由1 255個氨基酸殘基組成，能夠編碼185 kD的跨膜酪氨酸激酶受體蛋白，在胚胎發育時廣泛表達，而在分化成熟的組織中表達明顯下調[7]。ERBB2在多種上皮性腫瘤中均呈異常表達，對腫瘤細胞的分化、侵襲及瘤周血管的形成具有重要調控作用。在腦膠質瘤中，ERBB2基因呈高表達，誘導Akt活化，使癌細胞發生去凋亡化，促進膠質瘤細胞異常增殖[16]。研究表明[17]，在食管癌組織中，miR-193a-5p 通過靶向結合ERBB2 的3'-UTR，形成沉默復合物，阻礙ERBB2表達，從而使癌細胞的周期延長，分裂速度降低。本研究結果表明，EOC組織中ERBB2 mRNA相對表達量較癌旁組織升高，提示ERBB2對EOC的發生具有一定影響。其具體機制目前尚不清楚，可能是由于EOC組織的啟動子發生基因突變，其活性較正常組織明顯增強，從而使其轉錄效率明顯提高，導致癌組織中ERBB2 表達上調[16]。本研究結果表明，不同FIGO分期和淋巴結轉移患者的ERBB2 mRNA 相對表達量比較差異有統計學意義，提示ERBB2 參與調控EOC的進展。其原因可能是ERBB2 上調能夠誘導PI3K/Akt 信號通路活化，促進癌細胞進行無限有絲分裂，并縮短細胞分裂周期，使癌細胞迅速增殖、分化[18]。此外，高表達的ERBB2 能夠激活單體小分子三磷酸鳥苷酶（Ras）/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，從而促進下游靶基因分泌基質金屬蛋白酶（MMP）-2、9，使細胞外基質降解，利于癌細胞侵襲周圍正常細胞或向周圍組織器官轉移[9，19]。

Pearson 分析顯示，EOC 組織中miR-375 的表達與ERBB2的表達呈負相關，提示ERBB2可能是miR-375 的靶點，miR-375 通過調控ERBB2 的表達從而發揮相關生物學功能。癌組織中下調的miR-375 使具有酪氨酸殘基的生長因子受體磷酸化，改變其二聚體構象，激活PI3k/Akt 信號通路，從而促進腫瘤細胞生長[8]。ERBB2 與PI3K/Akt 信號通路存在正反饋調節機制，PI3K/Akt 信號通路活化能夠提高ERBB2 的分子活性[20]。因此，推斷miR-375可能通過PI3k/Akt信號通路調控ERBB2的表達，但其具體分子機制由于本研究設備限制，目前尚不清楚，需要后續實驗進一步研究。Kaplan-Meier生存曲線結果表明，當miR-375表達下調和ERBB2表達上調時，患者的預后生存時間更短，提示miR-375和ERBB2的表達與EOC患者預后生存時間密切相關。同時，Cox 回歸分析進一步證實miR-375 和ERBB2與EOC患者預后有關，提示miR-375和ERBB2可能作為預測患者預后生存時間的潛在生物標志物。

綜上所述，EOC 組織中miR-375 呈低表達而ERBB2 呈高表達，兩者呈負相關，且均與FIGO 分期及淋巴結轉移有關，對評估病情進展及其預后生存率具有重要的臨床價值。