MicroRNA與變應性鼻炎關系的研究進展

姜輝，王嘉璽，劉大新，丁雷

(北京中醫藥大學東方醫院耳鼻喉科，北京 100078)

變應性鼻炎是鼻黏膜慢性非感染性疾病，由免疫系統功能失調所致，一般認為變應性鼻炎屬于Ⅰ型超敏反應，兒童和成人均可罹患，患病率存在明顯地域和人群差異[1]。因變應性鼻炎具有反復發作的特點，嚴重影響患者的生活質量，增加社會醫療經濟負擔，同時其作為誘發哮喘的獨立危險因素，日益受到呼吸科和耳鼻喉科醫師的廣泛關注。尋找變應性鼻炎中特異性生物學標志物和治療靶點是臨床研究的熱點。目前臨床應用的各種檢測方法和治療手段均存在不同程度的局限性，檢測手段特異性差，而治療方法又難以從根本上解決問題。隨著高通量測序技術的不斷發展完善，微RNA(microRNA，miRNA)被大量發現，其生理學功能和機制明確，廣泛參與信號轉導、細胞增殖、分化、凋亡、應激反應等生物學過程，通過影響輔助性T細胞1/2的細胞極化、促進上皮慢性炎癥和組織重塑以及激活固有免疫細胞而抑制過敏性疾病的發展，并且在變應性鼻炎中發現了特異性miRNA表達譜[2-4]。因miRNA分子短小、在整個進化過程中高度保守等特質，可能成為變應性鼻炎特異性生物標志物和潛在的治療靶點。現就miRNA與變應性鼻炎的關系予以綜述。

1 miRNA概述

1.1miRNA研究歷程 1993年Lee等[5]在線蟲體內發現miRNA，被稱為“小分子時序RNA”[1]，屬于非編碼RNA，其長度為19～25個核苷酸。miRNA在物種間高度保守，廣泛存在于植物及動物體內，不參與蛋白質的加工合成，但miRNA以不完全堿基互補配對的方式與靶信使miRNA 3′非翻譯區相結合，主要發揮負向調控作用，在細胞的增殖、分化、凋亡、自噬等生理病理過程中扮演重要角色。2008年，Chen等[6]發現血清中存在游離的miRNA，截止到2018年3月，在miBase數據庫中確認了1 982條前體，2 694條成熟體，推測一個前體可以加工成多條miRNA成熟體。miRNA的組織特異性表明其有作為生物診斷標志物的潛在優勢，并且越來越多的研究表明，血清/血漿中循環miRNA可能作為惡性腫瘤的生物標志物[7-10]。

1.2miRNA的合成 miRNA從形成到成熟主要經歷三個階段：首先形成初級轉錄產物miRNA(primary-miRNA，pri-miRNA)，具有莖環結構，大小為幾百個甚至幾千個堿基；第二步形成miRNA前體(precursor-miRNA，pre-miRNA)，大小為70～90個堿基；第三步形成成熟miRNA，長度為19～25個核苷酸的單鏈RNA片段。

細胞核是pri-miRNA和pre-miRNA形成的場所，Drosha是加工pri-miRNA到pre-miRNA的核酸內切酶，Exportin與Ran-TP共同作用將pre-miRNA轉運至細胞質，被Dicer酶切產生切割成3′端含有兩個堿基的雙鏈miRNA，其中一條被降解，另一條單鏈形成miRNA成熟體。絕大部分哺乳動物的miRNA是通過結合到信使RNA(messenger RNA，mRNA)3′端非翻譯區后與靶mRNA的不完全互補來執行翻譯沉默。

1.3miRNA的作用機制 大多數miRNA通過抑制靶基因的表達發揮生物學作用，具體作用機制為與mRNA的3′端非翻譯區結合，進而阻礙mRNA在轉錄后水平對蛋白翻譯表達水平的影響，但并不影響mRNA的穩定性。但有研究結果與上述機制相反，認為少量miRNA亦可與mRNA的5′非翻譯區結合，結合方式可以完全互補，也可以非完全互補，導致相應蛋白質表達異常。目前與mRNA的3′非翻譯區結合進而影響蛋白翻譯和表達是主要研究方向[11]。

1.4miRNA命名原則 miRNA的命名隨著對其研究的不斷深入而日益完善，早期miRNA命名無規則，多以發現該miRNA學者的喜好命名，如lin-4、let-7。如新發現的miRNA與已有名稱高度同源，序列僅差1～2個堿基，則在第一個發現的miRNA后加a/b/c來區分。如果一條miRNA來源于不同的DNA編碼區域，即在基因組有平行的多個拷貝，還應在a/b/c后加-再以數字1/2/3來表示。miRNA前體是一個莖環結構，加工過程會從3′或 5′端莖環臂產生最終成熟的miRNA，但一般只有其中一條表達量高。最初將表達量低的加*號，也有以“-s”和“-as”來命名，最新的命名規則改用了來源于5′端的標5p，3′端標3p。目前miRNA的命名遵照雨果基因命名委員會2011年制訂的命名規則[12]：物種-miR-數字序號+字母-5p/3p，has(Homo sapiens)代表人，Mmu代表小鼠，Rno代表大鼠，如has-miR-181、has-miR-122等。

2 miRNA與變應性鼻炎

近年來，miRNA已成為多種炎癥和惡性疾病的非侵襲性生物標志物[13-15]。變應性鼻炎與炎癥關系密切，變應性鼻炎由IgE介導，肥大細胞脫顆粒釋放以組胺為主的多種活性物質，包括白細胞介素(interleukin,IL)-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13。此類介質作用靶點為鼻腔黏膜血管、腺體及神經末梢特異性受體，導致鼻腔局部病理改變，引起鼻黏膜血管收縮、通透性增強、腺體分泌增多、敏感性增強，相應局部癥狀體征表現為鼻黏膜蒼白水腫、鼻塞、鼻腔分泌物增多，以清稀鼻涕為主，晨起頻發噴嚏[16-17]。鼻腔黏膜敏感狀態易受外界冷、熱刺激而加重。上述癥狀中鼻塞為絕大多數患者就醫第一主訴，且對患者生活質量、睡眠質量、工作效率、學習狀態、記憶力等方面產生嚴重影響。此外，鼻腔局部黏膜長期處于病理狀態，可影響鄰近組織器官，出現過敏性結膜炎、鼻竇炎、鼻息肉、分泌性中耳炎等疾病。目前臨床觀察及動物模型基礎研究均證實，miRNA對炎癥因子具有負向調節作用，可改善過敏性鼻炎癥狀。盡管多項癌癥研究提示miRNA可作為疾病診斷、分級和監測的生物標志物[18-19]，但miRNA在變應性鼻炎中的研究仍十分有限。

2.1miRNA在變應性鼻炎中特異性表達 隨著以二代測序技術為代表的高通量測序技術的不斷發展完善，miRNA被大量發現，在眾多疾病中均扮演重要角色，在變應性鼻炎診斷特異性方面尤其突出。Chen等[20]應用miRNA陣列技術檢測變應性鼻炎小鼠和對照正常小鼠鼻黏膜中miRNA表達的差異，發現miRNAs在變應性鼻炎小鼠中有差異表達，包括25個miRNAs表達下調和57個miRNAs表達上調，其中miR-466a-3p在變應性鼻炎小鼠鼻黏膜中表達下調，miR-466a-3p的直接作用靶點為GATA結合蛋白3的3′非翻譯區，最終降低變應性鼻炎小鼠血清IgE和IL-4水平。

在成人變應性鼻炎的研究中，有研究者利用miRNA微陣列芯片分析確定了421種miRNA的差異表達，其中hsa-miR-7、hsa-miRPlus-E1194表達上調，hsa-miR-498、hsa-miR-187、hsa-miR-874、hsa-miR-143、hsa-miR-886-3p、hsa-miR-224和hsa-miR-767-5p表達下調[2，21]。后續有研究者在此基礎上發現變應性鼻炎患者鼻黏膜中miR-155、miR-205和miR-498表達水平升高，let-7e表達水平降低；皮膚過敏原點刺試驗陽性患者的miR-155/miR-205表達水平升高，let-7a表達降低，miR-126-5p、miR-19a-5p和miR-26a-5p的組合可以作為預測變應性鼻炎風險的生物標志物[22]。

變應性鼻炎具有遺傳傾向，有研究者通過對新生兒臍帶血的檢測證實，miR-21表達降低和重組人轉化生長因子-β受體2表達升高與產前IgE的產生和變應性鼻炎的發生發展相關[23]。對于靶基因的預測報道，黏蛋白7、N-乙酰-半胱氨酸等均與變應性鼻炎的發生發展相關[24]。有研究顯示，在小鼠體內靜脈或局部注射合成miRNA及其抑制劑幾乎未顯示出毒性[25]，其安全性也得到了有效證實。

2.2miRNA可抑制變應性鼻炎中多種炎癥反應 多種免疫活性細胞、細胞因子及炎癥介質在變應性鼻炎中扮演重要角色，多個動物實驗和臨床相關研究亦聚焦于阻斷細胞因子及炎癥介質的合成分泌，進而阻斷其病理過程，達到緩解臨床癥狀的目的[23-25]。大多數miRNA通過抑制靶基因的表達發揮生物學作用，具體作用機制為與mRNA 3′非翻譯區結合，進而阻礙mRNA在轉錄后水平對蛋白翻譯表達水平的影響。

動物實驗表明[26]，用BALB/c(巴比賽)小鼠經由卵清蛋白腹腔內注射及鼻黏膜增敏制作變應性鼻炎模型第7天，開始經鼻給予miR-133b激動劑7 d，記錄擦鼻及噴嚏的癥狀，收集鼻黏膜組織和血清，分別通過實時定量聚合酶鏈反應、酶聯免疫吸附測定法、免疫印跡和免疫組織化學法檢測miR-133b表達、血清卵清蛋白特異性IgE濃度、促炎細胞因子(IL-4、腫瘤壞死因子-α、IL-5、IL-10和γ干擾素)的水平及核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體激活，最后得出結論：miR-133b通過抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體介導的炎癥反應緩解變應性鼻炎小鼠的過敏癥狀。上調miR-133b可抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體激活，從而有效地改善變應性鼻炎炎癥反應，包括降低血清中特異性IgE濃度、嗜酸粒細胞和肥大細胞浸潤以及促炎細胞因子水平，并提出上調miR-133b可能是治療變應性鼻炎的一種潛在治療方法。

有研究將54例因鼻中隔偏曲住院的患者分為變應性鼻炎組(26例)和正常對照組(28例)，檢測兩組患者下鼻甲黏膜miR-155、IL-25、IL-33、Ⅱ型固有淋巴細胞的表達水平，結果顯示，與正常對照組相比，變應性鼻炎組患者鼻黏膜miR-155、IL-25、IL-33表達水平上調，Ⅱ型固有淋巴細胞的含量更高；隨后動物實驗將24只6～8周齡特異性無病原體雌性BALB/c小鼠隨機分為對照組、變應性鼻炎組、miR-155-agomir組和miR-155拮抗劑組，每組6只，結果證明miR-155能夠抑制變應性鼻炎 Ⅱ 型固有淋巴細胞中輔助性T細胞2因子(IL-4、IL-5、IL-9、IL-13)的釋放，從而減輕炎癥反應，預測miR-155和 Ⅱ 型固有淋巴細胞的表達可能是變應性鼻炎的潛在治療靶點[27]。

另一項對于變應性鼻炎小鼠模型的研究發現，miR-135a除抑制肥大細胞激活、顯著降低總IgE濃度外，還可顯著抑制嗜酸粒細胞和肥大細胞向鼻黏膜浸潤，并揭示其作用機制是通過調節肥大細胞中的GATA結合蛋白3來實現的[28]。

2.3miRNA可作為變應性鼻炎治療的潛在靶點 目前變應性鼻炎治療的研究熱點是抑制免疫活性細胞活性，減少細胞因子及炎癥介質分泌合成，緩解臨床癥狀(如鼻癢、鼻塞、清涕、噴嚏)。有研究發現，變應性鼻炎組與健康對照組miR-17、miR-18a、miR-19b、miR-20a和miR-92a水平比較差異無統計學意義，變應性鼻炎患者外周血B細胞中miR-19a水平明顯高于健康對照組，而IL-10表達明顯降低，推測miR-19a通過降低B細胞中IL-10的表達來抑制過敏原特異性免疫應答[29]。

有研究表明，變應性鼻炎患者血清miR-375與血液中靶基因磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、Janus激酶2和信號轉導及轉錄激活因子3的表達呈負相關，治療后血清腫瘤壞死因子-α、IL-6、IL-10和IL-13表達均顯著下降[30]。研究發現，與對照組小鼠相比，變應性鼻炎小鼠模型組外周血調節性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)和叉頭框蛋白P3的數量顯著減少，血清轉化生長因子-β和IL-10水平顯著降低，變應性鼻炎小鼠模型組外周血單核細胞miR-155和miR-181a的表達顯著降低，認為miR-181a和miR-155在變應性鼻炎中通過細胞因子信號抑制物1、沉默信息調節因子1和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路參與Treg細胞的增殖和功能[31]。另有研究顯示，miR-155a-5p通過負調控腎上腺素能受體2抑制IL-13介導的巨噬細胞、嗜酸粒細胞等炎癥因子的活化和黏蛋白5AC的分泌[32]。

上述研究表明，miRNA通過與mRNA 3′非翻譯區結合來阻止mRNA的翻譯和影響蛋白的表達。但有臨床研究得出相反的結論，在接觸性過敏性皮炎的研究中發現miR-126通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路促進Ca2+內流，加速IgE介導的肥大細胞脫顆粒，最終加重過敏性皮炎的癥狀[33]。

3 結 語

目前世界上有30%的人患有變應性鼻炎，尤其是兒童和青少年[34]。變應性鼻炎的主要臨床癥狀為陣發性或持續性鼻塞、大量清水樣鼻涕、頻繁發作性噴嚏、鼻癢，造成患者生活質量嚴重下降，同時變應性鼻炎也是誘發支氣管哮喘的重要危險因素。目前變應性鼻炎特異性診斷方法主要包括變應原皮膚點刺、血清特異性IgE，但兩者均有局限性。變應性鼻炎的治療主要包括藥物和手術兩方面，但藥物治療療效差，不良反應大[35]，手術治療需要嚴格把握適應證，同時要避免手術并發癥。因此，尋找變應性鼻炎的特異性診斷標志物和治療靶點具有重要意義。目前研究證明miRNA由多器官合成，以多種形式存在于血液和其他體液中發揮生物學作用[36-37]。miRNA在體液中的穩定性使其具有作為非侵入性診斷標志物的潛能。但miRNA在變應性鼻炎診斷及治療中的作用尚不完全明確，仍有待進一步完善。