線粒體分裂、線粒體自噬在煙草提取物誘導的支氣管上皮細胞損傷模型中的作用

王素文，宋小敏，李忱菲，魏良煜，張 海，李 鋒，王 炯

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是氣道和肺實質的慢性炎癥性疾病，據統計，全球有3.84億患者，具有高發病率和高死亡率的特點。多種因素可以導致COPD的發生發展，其中香煙煙霧是最常見的致病因素。研究表明，香煙煙霧可導致氣道上皮細胞線粒體結構與功能的紊亂，與COPD的發生發展緊密相關。

線粒體質量控制系統主要由線粒體分裂和線粒體自噬組成，是維持線粒體正常網絡結構的必備條件，也是維護線粒體功能正常的保障，該系統的紊亂會嚴重影響細胞功能，甚至導致細胞死亡。線粒體分裂過程主要由動力相關蛋白 1(dynamin related protein 1，DRP1)和線粒體分裂因子(mitochondrial fission factor，MFF)調控。而線粒體自噬過程受多種分子調控，損傷的線粒體最終由sequestosome 1(SQSTM1/p62)和微管相關蛋白1輕鏈3B，(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta，LC3B)形成自噬小體，由自噬小體呈送至溶酶體，進而通過自噬-溶酶體降解途徑完成線粒體的降解和再利用。線粒體自噬與細胞程序性壞死密切相關，后者是細胞程序性死亡的新形式，在受體相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)、RIPK1和混合譜系激酶結構域樣蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL)共同作用下發揮作用。程序性壞死的主要特征包括ATP水平下降，細胞內氧化物(reactive oxygen species，ROS)積累，鈣超載和線粒體通透性轉換孔的開放。該研究通過建立煙草提取物(cigarette smoke extract,CSE)誘導的支氣管上皮細胞損傷模型并加以干預，探討線粒體分裂和線粒體自噬及其下游的細胞程序性壞死在該模型中的變化與作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Beas 2b細胞株購自中國科學院上海生命科學研究所；DMEM高糖培養基、FBS購自美國GIBCO公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、青鏈霉素混合液、0.25%胰酶消化液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)購自上海碧云天生物科技有限公司；萬寶路香煙購自龍巖煙草工業有限公司；細胞增殖/毒性檢測試劑盒CCK8購自日本東仁公司；DCFH-DA購自美國Sigma-Aldrich公司；MitoTrackerGreen FM、MitoSOXRed Mitochondrial Superoxide Indicator購自美國Invitrogen公司；TRIzol試劑、Prime ScriptTM RT Master Mix Kit、Power Green qPCR mix購自大連TaKaRa公司；DRP1、MFF、β-actin抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗、HRP標記山羊抗小鼠IgG購自美國Cell signaling Technology公司；SQSTM1/p62、LC3B購自美國Abcam公司；Urolithin A、Mdivi-1購自美國SELLECK公司。

1.2 實驗分組

體外培養支氣管上皮細胞系Beas 2b細胞，分為對照組、5%CSE暴露組、5%CSE暴露+10 μmol/L線粒體分裂抑制劑Mdivi-1(Md)預處理組和5%CSE暴露+10 μmol/L線粒體自噬促進劑Urolithin A(UA)預處理組。預處理組藥物于5%CSE暴露前2 h加入與細胞共孵育。

1.3 實驗方法

1.3.1

細胞培養 Beas 2b細胞接種于含10% FBS的DMEM高糖培養基的無菌培養皿中，置于37 ℃、5% CO培養箱中孵育。細胞長至鋪滿皿底時用0.25%胰酶消化，傳代或鋪板。

1.3.2

CSE的制備 萬寶路香煙去除過濾嘴，用50 ml注射器以50 ml/min速度抽吸香煙煙霧，1支香煙完全燃燒產生的煙霧通過含5 ml無血清DMEM培養基的氣體采集管，該溶液用0.22 μm濾膜過濾除菌，最后所得溶液定義為100% CSE，在使用時稀釋成不同濃度，現制現用，15 min內用于實驗。

1.3.3

細胞增殖實驗 使用CCK8試劑測定細胞活力。Beas 2b細胞消化傳代，細胞計數調整濃度，接種于96孔板，每孔8 000個細胞，96孔板四周孔用PBS填充。鋪板過夜待細胞貼壁，給予CSE和藥物再培養24 h，棄培養基，用PBS清洗，根據CCK8操作說明，將檢測液與培養基1 ∶9配置成工作液，每孔加100 μl工作液，繼續孵育2 h后，用酶標儀測定每孔450 nm處吸光度(optical delnsity,OD)，計算出每組細胞相對增殖活性。

1.3.4

氧化應激檢測 使用DCFH-DA測定細胞內ROS。細胞接種于6孔板中，每孔加1 ml新配的DCFH-DA工作液，在37 ℃溫箱中避光孵育10 min，分別使用流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測。使用MitoSOX Red測定線粒體ROS，細胞接種于96孔黑色板中，每孔8 000個細胞，每組6個復孔，96孔板四周孔用PBS填充。根據MitoSOX Red操作說明制成5 mmol/L的工作液，每孔加100 μl工作液，避光孵育15 min，用預溫的PBS清洗兩次，激發光510 nm和發射光580 nm處用熒光酶標儀檢測。

1.3.5

線粒體形態檢測 使用MitoTrackerGreen FM染液檢測活細胞線粒體形態改變，細胞接種于共聚焦培養皿中，每孔5 000個細胞，按操作說明將儲存液配成100 nmol/L的工作液，每孔加500 μl，避光在37 ℃溫箱中孵育20 min，用無血清培養基清洗后，即刻用共聚焦顯微鏡拍攝，觀察線粒體形態變化。

1.3.6

qRT

-

PCR 實驗 檢測炎癥因子白細胞介素 (interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-18、趨化因子配體(chemokine ligands1，CXCL)1、CXCL8、程序性壞死因子(RIPK1、RIPK3、 MLKL)的mRNA水平。細胞培養在6孔板中，每孔加1 ml TRIzol提取總RNA，用逆轉錄試劑盒合成cDNA隨后進行qRT-PCR，反應條件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、34 s，40個循環，實驗結果用2方法計算。引物序列見表1。

表1 炎癥因子和程序性壞死分子的引物序列

1.3.7

Western blot實驗 細胞培養在6孔板中，每孔加100 μl的RIPA裂解緩沖液冰上裂解15 min，所提取的蛋白用BCA試劑盒定量。40 μg總蛋白在10.0%或12.5%的SDS-PAGE電泳，300 mA、60 min將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，然后分別放入一抗稀釋液(一抗配比 1 ∶1 000)中，4 ℃搖床孵育過夜。二抗稀釋液(二抗配比 1 ∶1 500)孵育2 h后顯影。結果用Image J軟件進行灰度分析統計。

1.4 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，制圖使用GraphPad Prism 6.0軟件。所有數值采用mean±SD表示，假設檢驗水準按α=0.05判定，

P

<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Md、UA抑制CSE暴露細胞的氧化應激水平

在細胞培養基中加入不同濃度CSE與細胞共培養24 h。5% CSE與細胞共培養時細胞活力出現下降，10% CSE時細胞活力明顯下降。隨著CSE濃度的增高，細胞內線粒體ROS逐漸增高，在5% CSE濃度時到達最高值(142.3±16.2)%，差異有統計學意義(

P

<0.001)。于是選擇5% CSE進行后續試驗。見圖1。在5% CSE暴露的細胞中，分別加入10 μmol/L的Md和10 μmol/L的UA，對細胞增殖活力無明顯影響(

P

>0.05)。5% CSE暴露導致細胞內ROS顯著升高[(132.4±6.4)%，

P

<0.001]、線粒體ROS顯著升高[(167.5±11.0)%，

P

<0.001]。Md、UA均可降低CSE暴露細胞內ROS、線粒體ROS水平，差異有統計學意義(均

P

<0.01,均

P

<0.001)，即Md/UA雖然不能提高細胞增殖活力，但可以降低CSE誘導的細胞氧化應激水平。見圖1。

圖1 Md、UA對CSE暴露細胞的氧化應激水平的影響A：不同濃度CSE對細胞增殖的影響；B：不同濃度CSE對細胞線粒體ROS的影響；與對照組比較：**P<0.01,***P<0.001;C：Md、UA對CSE暴露細胞增殖的影響；D：Md、UA對CSE暴露細胞線粒體ROS的影響；E:Md、UA對CSE暴露細胞總ROS的影響；與CSE組比較：**P<0.01,***P<0.001

2.2 Md、UA恢復CSE暴露細胞的線粒體形態

正常的細胞內線粒體為網絡狀結構，在應激狀態下(如煙草暴露)，線粒體的網絡結構發生改變，可表現為線粒體聚集。對照組細胞線粒體形態正常，呈網絡狀結構； 5% CSE暴露組細胞的線粒體網絡狀結構破壞、線粒體聚集成團[(18.4±6.2)%，

P

<0.05]。Md、UA預處理部分恢復CSE暴露的細胞線粒體網絡結構[(110.5±56.6)%、(91.5±15.9)%，

P

<0.01、

P

<0.05]。見圖2。

圖2 Md、UA對CSE暴露細胞線粒體形態的影響 ×630A：Md、UA對CSE暴露細胞線粒體形態變化代表圖；B：線粒體面積統計分析圖；與CSE組比較：*P<0.05,**P<0.01

2.3 Md、UA抑制CSE暴露細胞的炎癥因子水平

5% CSE刺激細胞炎癥因子(IL-1β、IL-6、IL-18、CXCL1、CXCL8)的mRNA表達增加(

P

<0.001、

P

<0.01、

P

<0.01、

P

<0.05、

P

<0.05)。Md預處理抑制炎癥因子(IL-1β、IL-6、IL-18、CXCL1、CXCL8)mRNA表達(

P

<0.01、

P

<0.05、

P

<0.05、

P

<0.05、

P

<0.01),UA預處理抑制炎癥因子(IL-1β、IL-6、IL-18、CXCL8)mRNA表達(

P

<0.01、

P

<0.01、

P

<0.05、

P

<0.01)。見圖3。

圖3 Md、UA對CSE暴露細胞炎癥因子mRNA水平的影響 1：對照組；2：CSE；3：CSE+Md；4:CSE+UA;與CSE組比較:*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001

2.4 Md、UA抑制CSE暴露細胞的線粒體分裂蛋白表達

5% CSE組的線粒體分裂蛋白(DRP1、MFF)表達增高[(1.459±0.281)、(2.023±0.416)]，且差異有統計學意義(

P

<0.05、

P

<0.01)。Md、UA預處理均可抑制線粒體分裂蛋白(DRP1、MFF)表達水平，且差異有統計學意義(

P

<0.01、

P

<0.05、

P

<0.05、

P

<0.05)。見圖4。

圖4 Md、UA對 CSE暴露細胞的線粒體分裂蛋白表達的影響 A：Md、UA對CSE暴露細胞線粒體分裂蛋白DRP1變化代表圖；B：Md、UA對CSE暴露細胞線粒體分裂MFF蛋白變化代表圖；C：DRP1蛋白統計分析圖；D：MFF蛋白統計分析圖；1：對照組；2：CSE；3：CSE+Md；4:CSE+UA;與CSE組比較:*P<0.05，**P<0.01

2.5 Md、UA影響CSE暴露細胞的線粒體自噬蛋白的蛋白表達水平

5% CSE刺激細胞中線粒體自噬蛋白p62/SQSTM1蛋白表達增高[(3.593±0.097)，

P

<0.001]，LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達下降[(0.528±0.032)，

P

<0.001]； Md預處理增加線粒體自噬蛋白p62/SQSTM1蛋白表達水平[(4.327±0.534)，

P

<0.05]，不影響線粒體自噬蛋白LC3BⅡ/Ⅰ表達。UA預處理抑制線粒體自噬蛋白p62/SQSTM1蛋白表達[(2.901±0.300)，

P

<0.05]，增加線粒體自噬蛋白LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達[(0.805±0.202)，

P

<0.05)]。見圖5。

圖5 Md、UA對 CSE暴露細胞的線粒體自噬蛋白表達的影響 A：Md、UA對CSE暴露細胞線粒體自噬蛋白p62/SQSTM1變化代表圖；B：Md、UA對CSE暴露細胞線粒體自噬蛋白LC3BⅡ/Ⅰ變化代表圖；C：p62/SQSTM1蛋白統計分析圖；D：LC3BⅡ/Ⅰ蛋白統計分析圖；1：對照組；2：CSE；3：CSE+Md；4:CSE+UA;與CSE組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.6 Md、UA抑制CSE暴露細胞的程序性壞死組分mRNA水平

5% CSE刺激細胞中程序性壞死組分(RIPK1、RIPK3、MLKL)mRNA表達增高(均

P

<0.001)。Md預處理抑制細胞程序性壞死組分(RIPK1、RIPK3、MLKL)mRNA表達水平(

P

<0.001、

P

<0.01、

P

<0.01)。UA處理抑制細胞程序性壞死組分(RIPK1、MLKL)mRNA表達水平(

P

<0.01、

P

<0.001)。見圖6。

圖6 Md、UA對CSE暴露細胞的細胞程序性壞死組分mRNA水平的影響1：對照組；2：CSE；3：CSE+Md；4:CSE+UA;與CSE組比較：**P<0.01，***P<0.001

3 討論

外部刺激物如香煙煙霧和環境毒素，或細胞內刺激物如ROS，均會導致線粒體受損，線粒體功能障礙。受損傷線粒體積累會導致ROS增多、ATP水平下降、線粒體DNA損傷和錯誤折疊的蛋白增多，這會導致細胞損傷進一步加重。缺乏功能性線粒體的人肺泡上皮細胞中促炎細胞因子產生增加和細胞修復受損，可見線粒體的功能正常對于細胞抵抗外界刺激具有非常重要的作用。本研究證實，CSE可引起氣道上皮細胞損傷和線粒體損傷，具體表現為細胞內ROS、線粒體ROS增加，炎癥因子表達增加，以及線粒體網絡狀結構皺縮、線粒體分裂蛋白表達增加、細胞程序性壞死組分mRNA表達增加。

在應激狀態下，線粒體分裂增多，線粒體一分為二，可重新利用的線粒體通過線粒體融合快速供能，而線粒體分裂產生的碎片通過線粒體自噬將受損的線粒體通過形成自噬小體重新分解再利用，從而減少損傷線粒體的積累，維持細胞穩態。線粒體動態調節是個復雜且相互影響的過程，不同的調控過程對細胞的結局會有不同的影響。當過表達DRP1會導致線粒體碎裂，線粒體膜電位下降；當敲除DRP1的受體分子FIS1或MFF，會抑制線粒體分裂，線粒體自噬水平下降，恢復線粒體膜電位。線粒體解偶聯劑會導致線粒體功能障礙，通過上調DRP1表達水平，增加線粒體自噬水平。有研究顯示在COPD患者肺組織中線粒體自噬不充分導致線粒體碎片增加，同時，線粒體自噬水平下降伴隨p62/SQSTM1蛋白的積累。在哺乳動物中，LC3BⅠ到LC3BⅡ(自噬體膜相關的磷脂酰乙醇胺結合形式)的轉化是自噬體形成的標志，常用LC3BⅡ/Ⅰ增高提示自噬水平增高。本研究中5% CSE刺激氣道上皮細胞，線粒體分裂蛋白(DRP1、MFF)蛋白表達增加，而線粒體自噬蛋白p62/SQSTM1水平增高，同時LC3BⅡ/Ⅰ水平下降，即線粒體自噬水平下降。本研究證實香煙煙霧提取物誘導氣道上皮損傷模型中線粒體質量控制系統失衡，即線粒體分裂增加而線粒體自噬下降。

凋亡和程序性壞死都是程序性細胞死亡方式，且凋亡和程序性壞死在COPD中均發揮重要的作用。體外研究顯示，CSE作用于Beas 2b細胞導致程序性壞死，細胞膜完整性破壞，損傷相關的分子模式(damage associated molecularpattern,DAMP) 增加。在小鼠模型中，煙草暴露會增加小鼠支氣管肺泡灌洗液中DAMP的水平和中性粒細胞的數量。本研究證實CSE刺激Beas 2b細胞的程序性壞死組分mRNA水平增加，即增加程序性壞死水平。

Md是一種喹唑啉酮，是DRP1的選擇性抑制劑，可抑制線粒體分裂。有研究顯示，Md通過減少線粒體分裂而抑制線粒體自噬水平從而發揮保護作用。本研究中加入10 μmol/L Md預處理，檢測到細胞內、線粒體ROS水平下降，炎癥因子mRNA水平下降，線粒體網絡狀結構部分恢復，線粒體分裂蛋白水平下降，p62/SQSTM1蛋白水平增加，LC3BⅡ/Ⅰ蛋白水平無明顯改變，細胞程序性壞死組分mRNA水平下降。即本研究證實，在CSE誘導的肺上皮細胞損傷模型中，Md抑制線粒體分裂、抑制線粒體自噬，恢復線粒體結構和功能，從而減少細胞程序性死亡，抑制細胞炎癥反應。

UA是鞣花單寧的代謝物之一，在秀麗隱桿線蟲和人類神經元細胞中可促進線粒體自噬，是一種新型的線粒體自噬促進劑。本研究發現，10 μmol/L UA抑制細胞內、線粒體內ROS水平、炎癥因子mRNA水平，部分恢復線粒體網絡結構，抑制線粒體分裂蛋白水平和線粒體自噬蛋白p62/SQSTM1蛋白水平，增加LC3BⅡ/Ⅰ蛋白水平，抑制細胞程序性壞死組分mRNA水平。即本研究證實，在CSE誘導的肺上皮細胞損傷模型中，UA抑制線粒體分裂水平、增加線粒體自噬水平，恢復線粒體結構和功能，從而減少細胞程序性死亡，抑制細胞炎癥反應。

綜上所述，本研究證實，CSE誘導支氣管上皮細胞損傷模型中存在線粒體質量控制系統失衡，即線粒體分裂增多以及線粒體自噬不足。通過抑制線粒體分裂和適度促進線粒體自噬，進而抑制細胞程序性壞死組分mRNA水平，對細胞發揮保護性作用，表現為抑制氧化應激和炎癥反應，部分恢復線粒體結構。本實驗仍有不足之處，關于線粒體質量控制在CSE誘導支氣管上皮細胞損傷模型中的分子作用機制在后續實驗會進一步探索。