YAP基因多態性與幽門螺桿菌感染及非賁門胃癌發病風險的關聯性分析

馬立聰，田旭陽*，王興宇，高 芳，董文杰，武金寶，黨 彤，賈彥彬,,5

胃癌是一種復雜的多因素、多階段疾病，幽門螺桿菌(

Helicobacter

pylori

,Hp)是胃癌的重要致病因素之一，資料顯示74.7%～89.0%的胃癌患者曾感染過Hp，世界范圍內約有50%的人群曾感染過Hp，但最終僅有1%～3%罹患胃癌，提示個體的遺傳因素在胃癌變過程中扮演了重要的角色。Hippo信號通路是哺乳動物中的一條腫瘤抑制通路，參與細胞的增殖、分化和死亡，調節組織器官大小。Yes相關蛋白(Yes associated protein,YAP)是Hippo信號通路中的效應因子，與正常胃黏膜比較，胃癌組織的YAP表達水平明顯上調，并且與胃癌預后差相關，因此，

YAP

是研究胃癌變的重要候選基因之一。研究報道

YAP

基因SNP rs11225163可能與皮膚黑色素瘤以及肝細胞癌的發病關聯，SNP rs1820453與女性乳腺癌發病風險以及小細胞癌患者的生存率相關，但是有關

YAP

基因多態性與Hp感染以及非賁門胃癌發病風險的關聯性研究未見報道。該研究檢測了SNP rs11225163和rs1820453與Hp感染以及非賁門胃癌發病風險的關系，旨在為胃癌以及Hp感染相關疾病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料

研究對象在課題組已發表文獻中詳細描述，即病例組381例，為2008—2017年在包頭市腫瘤醫院經病理學確診為非賁門胃癌的患者，所有患者均為漢族，且三代無與其他民族通婚史，發病時已在包頭市居住5年以上的原發病例,并且未接受過化療和放療。對照組共427例，為同期包頭醫學院第一附屬醫院和內蒙古包鋼醫院的正常體檢人群，所有對照均為漢族，且三代無與其他民族通婚史，已在包頭市居住5年以上，并且未接受過Hp根除治療，無胃部疾病史和其他遺傳病。所有參加本研究的患者和對照者留取2 ml外周血，并提供知情同意書，本研究已獲包頭醫學院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1

SNP的篩選 根據HapMap數據庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的中國漢族人群多態性數據，在

YAP

基因進行了標記單核苷酸多態性(Tag-SNP)的篩選，要求最小等位基因頻率(MAF)>0.05，連鎖不平衡相關系數(r)>0.8。根據文獻報道的可能與疾病相關的SNP，優先選擇了rs11225163和rs1820453兩個多態性位點進行分析。

1.2.2

基因分型 采用外周血DNA提取試劑盒提取808例樣本外周血白細胞DNA，試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。采用Taqman探針法對808例樣本進行基因分型，基因分型在北京賽默百合生物科技有限公司完成。實驗中設陰性對照和陽性對照，基因分型沒有成功的樣本不再進行重復實驗。實驗中隨機選取5%DNA質量和數量較好的樣本進行重復實驗，以驗證結果的準確性。經檢測，所有重復樣本基因分型結果的一致性為100%。

1.2.3

正常對照中Hp感染的檢測 采用血清學方法檢測Hp的感染情況。使用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法確定正常對照外周血血清中抗Hp抗體的滴度。試劑盒購自蘇州艾萊薩生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作和結果判定。

1.3 統計學處理

采用R軟件(version3.5.0; http://www.r-project.org)進行統計分析，年齡采用

t

檢驗比較病例組和對照組間的差異，性別采用χ檢驗比較組間分布差異。使用R軟件的“genetics”包的Pearson χ檢驗，檢驗各基因多態位點的基因型分布在對照組人群中是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。采用非條件性Logistic回歸法計算經年齡、性別調整后的

OR

值以及95%

CI

，用以評估兩個SNP在共顯性、顯性、超顯性、隱性和附加等5種遺傳模式下與Hp感染以及非賁門胃癌發病風險的關聯性，采用Haploview 4.2軟件構建單體型，分析單體型與Hp感染以及非賁門胃癌發病風險的關聯。

2 結果

2.1 808例樣本一般情況比較

本實驗共納入研究樣本808例，其中非賁門胃癌患者(病例組)381例，正常人群(對照組)427例。病例組中男性286例(75.1%)，女性95例(24.9%)，年齡中位數為60歲，四分位間距為52～69歲；對照組中男性320例(74.9%)，女性107例(25.1%)，年齡中位數為57歲，四分位間距為50～65歲。統計結果顯示，病例組與對照組的年齡分布差異有統計學意義(

t

=-4.437，

P

<0.001)，性別分布差異無統計學意義(χ=0.002，

P

>0.05)。

2.2 對照組Hp感染陽性和陰性的一般情況比較

對照組中，Hp感染呈陰性和陽性者分別為225例和202例,陽性率為47.3%。在Hp感染陰性組中，男性和女性分別為169例(75.1%)和56例(24.9%)，年齡中位數為54歲，四分位間距為50～66歲；在Hp感染陽性組中，男性和女性分別為151例(74.8%)和51例(25.2%)，年齡中位數為53歲，四分位間距為49～64歲。統計結果顯示，Hp感染陰性組與Hp感染陽性組的年齡分布差異無統計學意義(

t

=0.863，

P

>0.05)，性別分布差異無統計學意義(χ=0.007，

P

>0.05)。

2.3 對照組

基因SNP rs11225163和rs1820453與Hp感染的關聯性

在正常對照中，SNP rs11225163和rs1820453的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，提示所選樣本具有人群代表性。統計結果顯示，

YAP

基因SNP rs11225163和rs1820453在共顯性、顯性、超顯性、隱性和附加等5種遺傳模式下與Hp感染均無關聯，見表1。

表1 5種遺傳模型下SNP rs11225163、rs1820453與Hp感染的關聯性

2.4

基因SNP rs11225163和rs1820453與非賁門胃癌的關聯性

統計結果顯示，

YAP

基因SNP rs11225163和rs1820453在共顯性、顯性、超顯性、隱性和附加等5種遺傳模型下與非賁門胃癌均無關聯，見表2。

表2 5種遺傳模型下SNP rs11225163、rs1820453與非賁門胃癌發病風險的關聯性

2.5

基因的單體型與Hp感染及非賁門胃癌發生的關系

使用Haploview 4.2軟件對

YAP

基因2個位點進行連鎖不平衡分析，計算LOD值、連鎖不平衡系數D′，采用D′置信區間法構建單體型。結果顯示，以Hp感染或非賁門胃癌為結局變量，所研究的

YAP

基因2個SNP位點之間均未構成單體型塊。

3 討論

目前，攻克胃癌仍是世界性難題，其發病率和死亡率均位居所有惡性腫瘤前列，雖然隨著醫療水平的提升，其致死率有所下降，但每年在世界范圍內仍有100萬左右的新發病例，嚴重影響著人類的健康。早發現、早診斷、早治療對于胃癌患者至關重要，尋找切實有效的生物標志物以及精準的靶向治療一直是人們努力的方向。Hp是目前公認的引起胃癌的危險因子，并于1994年被國際癌癥研究機構定義為胃的Ⅰ類致癌原，環境和宿主等多因素作用會導致Hp的感染。首先Hp感染并定植于胃黏膜，導致一種慢性持久性炎癥-慢性萎縮性胃炎，如果不進行干預和治療，這種慢性炎癥將會持續數年至數十年，持續的慢性萎縮性胃炎經過腸上皮化生-低級別上皮內瘤變-高級別上皮內瘤變，最終會導致<3%的Hp感染者罹患胃癌。胃癌分為賁門癌和非賁門癌兩類，賁門癌在流行病學、臨床病理特征及分子生物學特征等方面與食管癌相近，為了保持研究樣本的均質性，本研究中我們將病例限定為非賁門胃癌。

Hippo信號通路是一條腫瘤抑制通路，它在哺乳動物中高度保守，由13個核心組件構成，其中YAP是通路中的效應因子，受上游活化的LATS蛋白的磷酸化作用使其激活，作為轉錄共調節因子與轉錄因子TEAD結合，調控細胞增殖、分化以及死亡，調節組織器官大小。本課題組在前期研究中發現，位于YAP上游的LATS蛋白在非賁門胃癌組織中的表達水平顯著低于正常胃組織，并且

LATS

基因SNP與Hp感染及非賁門胃癌的發病風險關聯。因此，本研究繼續檢測了

YAP

基因多態性與Hp感染及非賁門胃癌的發病風險的關聯性。Yuan et al在美國德克薩斯州人群中的調查發現，

YAP

基因SNP rs11225163與皮膚黑色素瘤的發病相關，攜帶CC基因型與較短的生存期相關。此外，El-Derany et al的研究表明，在埃及男性患者中，

YAP

基因SNP rs11225163與肝細胞癌的發病相關，C等位基因在非酒精性脂肪肝患者中與肝細胞癌的發病呈負相關。Chen et al在研究中發現

YAP

基因SNP rs1820453與中國女性乳腺癌的發病相關，攜帶CC基因型者患乳腺癌的風險顯著增加。Wu et al發現，攜帶

YAP

rs1820453 TG或GG基因型的小細胞肺癌患者生存率下降，G等位基因是影響小細胞肺癌患者預后的因素之一。目前國內外尚無有關

YAP

基因多態性與Hp感染及胃癌發病風險的關系的報道。本研究中，我們通過病例對照關聯研究的方法在808例樣本中研究了

YAP

基因SNP rs11225163和rs1820453與Hp感染及非賁門胃癌發病風險的關系，并未發現這兩個SNP與Hp感染以及非賁門胃癌的發病風險有關聯，與上述文獻報道不符，首先這可能是由于同一多態性在不同的疾病中起到的作用不同導致；其次也可能與各項研究的對象的種族和人群亞結構的差異相關；第三，本研究樣本量偏少，僅納入808例樣本，因此實驗結果還需進一步研究證實。