LncRNA-MEG3在心肌纖維化過程中的表達(dá)變化研究

蔣書美,施 鵬,王立超,王 璨,徐盛松,石開虎

心肌纖維化是心血管疾病中心臟重塑的主要病理特征，包括心房顫動(atrial fibrillation，AF)、心肌梗死(myocardial infarction，MI)和心臟衰竭等，其特征是心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)增加、心肌間質(zhì)膠原合成增加、降解減少、排列紊亂,主要機制為CFs的激活進(jìn)而轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞導(dǎo)致I型膠原(Collagen type I，Collagen I)和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)等蛋白的合成增加，最后細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積發(fā)生心肌纖維化。研究表明，表觀遺傳修飾參與調(diào)控CFs細(xì)胞的活化增殖，如非編碼RNA修飾等，但調(diào)節(jié)心肌纖維化的具體發(fā)生機制仍有待于研究闡明。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的RNA分子，在多種層面上參與相關(guān)目的基因表達(dá)的調(diào)控。有文獻(xiàn)報道，LncRNA在心血管疾病發(fā)生中起著重要的調(diào)節(jié)作用。人母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene3，MEG3)位于人類染色體14 q 32.3區(qū)的DLK1-MEG3位點,其編碼產(chǎn)物是一條長約1.6 kb的LncRNA，功能上MEG3具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移作用，但其對心肌纖維化調(diào)控的研究目前知之甚少。該研究以異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)構(gòu)建的大鼠心肌纖維化模型及TGF-β1刺激誘導(dǎo)CFs模型為研究對象，分別檢測MEG3的表達(dá)變化情況，以此來探究MEG3對大鼠心肌纖維化及CFs活化增殖的可能作用，為心肌纖維化的機制研究和預(yù)防提供潛在的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1

實驗動物 雄性SD大鼠20只，7～8周齡，體質(zhì)量(200±10)g，乳鼠40只，出生1～3 d，體質(zhì)量(10±2)g，均購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SYXK(皖)2017-001。

1.1.2

主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胰蛋白酶(加拿大WISENT公司)；蛋白酶抑制劑PMSF、細(xì)胞組織裂解液RIPA(上海Beyotime公司)；α-SMA、Collagen I一抗(武漢博士德生物公司)及相關(guān)二抗(北京中杉金橋)；TRIzol試劑(美國Life Technology公司)；MEG3及相關(guān)膠原分子的引物(上海生工生物工程有限公司)；TBGreen試劑(日本TaKaRa公司)；CCK-8試劑(Biosharp公司)。

1.1.3

主要儀器 EPS電泳儀(上海天能科技有限公司)、顯影機等相關(guān)Western blot設(shè)備(上海Tanon公司)；生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；預(yù)冷離心機(德國Eppendorf公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；逆轉(zhuǎn)錄儀、PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1

心肌纖維化動物模型的建立及病理學(xué)檢測 取SD大鼠20只，隨機分為ISO組和對照組。ISO組大鼠腹部皮下注射ISO 5 mg/kg，2周，對照組腹部皮下注射等量生理鹽水，2周，取心臟組織標(biāo)本。一部分用甲醛液固定后石蠟切片，行HE、Masson染色，觀察膠原表達(dá)變化；另一部分用于提取組織蛋白和RNA，行Western blot、qRT-PCR實驗。

1.2.2

提取乳鼠原代心肌成纖維細(xì)胞 取出生1～3 d的乳鼠，將其處死消毒后取出心臟并用PBS清洗兩遍。然后取心臟組織，將其剪碎放置50 ml離心管中并加入胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶(2 ∶1)消化10 min后取上清液至10 ml離心管中，立即加入培養(yǎng)基中和消化酶，接著離心機中離心10 min(轉(zhuǎn)速3 500 r/min、重復(fù)3次)，離心后棄上清液加入培養(yǎng)基吹勻接種至培養(yǎng)瓶中并將其轉(zhuǎn)至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，貼壁的即是CFs，顯微鏡下觀察CFs為大的梭型有觸角的細(xì)胞。待細(xì)胞長至80%左右時予以傳代處理，傳至1～2代后行相關(guān)實驗。

1.2.3

CFs分組與培養(yǎng) 用胰酶將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化下來后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，吹勻后等量種到6孔板中。TGF-β1組予以10 ng/ml TGF-β1刺激作用CFs，對照組為未予以TGF-β1刺激，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱相同條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.4

Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 用配制好的混合裂解液(PMSF ∶RIPA=1 ∶100充分混勻)在冰浴中裂解提取各組的組織和細(xì)胞蛋白。按配方配制電泳緩沖液，轉(zhuǎn)膜液，TBST。電泳：按分組加入相應(yīng)組織及細(xì)胞蛋白樣品；接電源、80 V、30 min后改 120 V、1 h左右。轉(zhuǎn)膜：設(shè)定恒流200 mA進(jìn)行轉(zhuǎn)膜100 min左右。封閉：將膜放入TBST配制的5%脫脂牛奶，搖床慢搖封閉1.5 h左右。孵育抗體：將膜放入配制好的一抗，4 ℃冰箱過夜；第2天用TBST液快搖床洗膜3次、每次10 min；然后孵二抗，搖床慢搖孵育1 h，再用TBST液洗3次后顯影。

1.2.5

qRT-PCR法檢測相關(guān)mRNA與MEG3的表達(dá) 用預(yù)冷的TRIzol提取組織和細(xì)胞的總RNA，然后加入DEPC水吹勻測濃度和純度，確保260 nm/280 nm OD值在1.8～2.0之間。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后行目標(biāo)cDNA 的擴增(qRT-PCR)：用無酶水配制目標(biāo)基因的引物，取cDNA樣本1.6 μl、被擴增基因的引物3.2 μl加入到相應(yīng)的八聯(lián)管中，然后在避光的環(huán)境下每孔加入5.2 μl的TBGreen至總反應(yīng)體系總量為10 μl。按如下步驟進(jìn)行目標(biāo)基因擴增：預(yù)變性階段50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；擴增階段95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)；溶解曲線階段 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以β-actin為內(nèi)參，用2法計算各組目標(biāo)基因的表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列

1.2.6

CCK-8法檢測CFs的OD值 用胰酶將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化下來進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，以3 000個細(xì)胞/孔均勻的接種到96孔板中，每孔加培養(yǎng)基至100 μl。將CFs分為A、B、C三組，其中A組為未加TGF-β1刺激，B、C兩組分別予以10 ng/ml TGF-β1刺激作用24、48 h，在相同條件下培養(yǎng)48 h后，每孔加入4 ℃保存的CCK-8試劑10 μl，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，最后測每孔在波長450 nm處的OD值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌組織病理學(xué)改變

心肌組織切片HE染色中細(xì)胞核被染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)被染成紅色，與對照組比較，ISO組的心肌細(xì)胞體積明顯增大、大小不一且排列紊亂，組織病理改變更為明顯，見圖1。Masson染色中細(xì)胞核被染成黑色，細(xì)胞外膠原纖維被染成藍(lán)紫色，與對照組比較，ISO組的大鼠心肌細(xì)胞肥大紊亂，心肌膠原纖維化面積明顯增多，見圖2。

圖1 大鼠心肌組織的HE染色圖 ×400A：對照組;B：ISO組

圖2 大鼠心肌組織的Masson染色圖 ×400A：對照組;B：ISO組

2.2 大鼠心肌組織中Collagen I、α-SMA分子蛋白和mRNA的表達(dá)變化

Western blot檢測大鼠心肌組織蛋白結(jié)果提示：與對照組比較，ISO組的心肌組織中Collagen I、α-SMA分子蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，見圖3。 qRT-PCR法檢測結(jié)果提示：與對照組比較，ISO組的心肌組織中Collagen I、α-SMA的mRNA表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，見圖4。

圖3 大鼠心肌組織中Collagen I、α-SMA分子的蛋白表達(dá)變化A：對照組;B：ISO組；與對照組比較：*P<0.05

圖4 大鼠心肌組織中Collagen I、α-SMA的mRNA表達(dá)變化A：對照組;B：ISO組；與對照組比較：*P<0.05

2.3 TGF-β1 刺激誘導(dǎo)CFs中Collagen I、α-SMA分子蛋白及mRNA的表達(dá)變化

用TGF-β1刺激CFs 48 h后，Western blot檢測結(jié)果提示：與對照組比較，TGF-β1組中Collagen I、α-SMA分子蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，見圖5。qRT-PCR檢測結(jié)果提示：與對照組比較，TGF-β1組中Collagen I、α-SMA的mRNA表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，見圖6。

圖5 TGF-β1刺激CFs 48 h后Collagen I、α-SMA的蛋白表達(dá)變化A：對照組;B：TGF-β1組；與對照組比較：*P<0.05

圖6 TGF-β1刺激CFs 48 h后Collagen I、α-SMA的mRNA表達(dá)變化A：對照組;B：TGF-β1組；與對照組比較：*P<0.05

2.4 CCK-8檢測TGF-β1刺激CFs后的OD值變化

CCK-8檢測結(jié)果提示：與對照組比較，TGF-β1刺激CFs 24 h和48 h后CFs的OD值均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0

.

05)，見圖7。說明TGF-β1刺激CFs后的細(xì)胞增殖活性有所增加。

圖7 TGF-β1刺激CFs 24、48 h后CFs的OD值變化A：對照組；B：TGF-β1刺激CFs 24 h后；C：TGF-β1刺激CFs 48 h后；與對照組比較：*P<0.05

2.5 大鼠心肌組織和CFs中LncRNA-MEG3的表達(dá)變化

qRT-PCR檢測結(jié)果提示：與對照組比較，在動物實驗組(ISO組)的心肌組織中和細(xì)胞實驗組(TGF-β1組)的CFs中LncRNA-MEG3的表達(dá)都明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0

.

05)，見圖8。

圖8 大鼠心肌組織和CFs中MEG3的表達(dá)變化A：動物實驗；B：細(xì)胞實驗；與對照組比較：*P<0.05

3 討論

心肌纖維化被認(rèn)為是眾多心臟疾病的終末病理表現(xiàn)，CFs的活化增殖導(dǎo)致α-SMA、Collagen I等膠原分子合成的增加是心肌纖維化的主要發(fā)生機制，但具體發(fā)生機制尚未完全研究清楚。研究表明LncRNAs在細(xì)胞增殖、分化和變性中發(fā)揮重要作用，包括對心肌纖維化中CFs的活化增殖過程也具有重要的調(diào)控作用，例如本課題組前期驗證過LncRNA-Gas5可通過調(diào)控CFs的凋亡來影響心肌纖維化的發(fā)生,起到抑制心肌纖維化的作用。

LncRNA-MEG3是非編碼RNA中的一種，其在腫瘤增殖中研究較多，且已被證明具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖生長的作用，如在肺癌、胃癌等腫瘤中LncRNA-MEG3表達(dá)降低。同時也有報道LncRNA-MEG3在糖尿病腎病腎臟纖維化和肺纖維化發(fā)生過程中起調(diào)控作用，但其在心肌纖維化發(fā)生過程中的機制研究較少。本研究在大鼠ISO模型的心肌組織中和TGF-β1刺激 CFs中檢測到α-SMA、Collagen I在蛋白和基因水平都較對照組表達(dá)顯著增加；同時TGF-β1刺激CFs后較對照組增殖活性明顯增加，說明心肌纖維化動物和細(xì)胞模型建立成功。我們發(fā)現(xiàn)在心肌纖維化動物和細(xì)胞模型組中LncRNA-MEG3的表達(dá)較對照組都是明顯降低的。Piccoli et al研究在心臟疾病晚期重塑過程中，CFs中的LncRNA-MEG3表達(dá)也是下調(diào)的，其結(jié)果與本研究是一致的。間接說明LncRNA-MEG3可能在心肌纖維化及CFs活化增殖形成過程中發(fā)揮了負(fù)調(diào)控作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了LncRNA-MEG3在心肌纖維化動物和細(xì)胞模型組中表達(dá)明顯降低，其在心肌纖維化過程中可能起到抑制作用，但本研究只是在組織和細(xì)胞水平的初步驗證，LncRNA-MEG3在心肌纖維化發(fā)生中的具體調(diào)控通路還有待于繼續(xù)深入研究。