膠質瘤細胞外泌體通過miR-125b對細胞增殖凋亡的影響

劉彥廷，孫 拯，王壯壯，龔 偉，馬金陽，田春雷

膠質瘤是中樞神經系統常見的惡性腫瘤之一，目前臨床上多采用手術+放化療等綜合治療為主，但患者復發率極高，整體預后差。膠質瘤細胞可分泌一種直徑約40～100 nm細胞外膜性囊泡，即外泌體，不僅可作為細胞間的通信載體，還可通過攜帶miRNAs調控腫瘤細胞的增殖凋亡。目前發現，miR-125b與膠質瘤組織惡性程度存在相關性，可通過抑制下游靶基因，調控膠質瘤細胞的增殖凋亡。如：miR-125b可通過抑制DNA損傷DRAM2、P53和P38等靶基因，改變腫瘤細胞的增殖活性。該研究擬通過提取膠質瘤細胞的外泌體，將其與U251細胞共培養，觀察外泌體能否通過miRNAs調控膠質瘤細胞增殖凋亡，為該領域的研究提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人膠質瘤細胞U251與人星型膠質細胞購于南方醫科大學神經病學研究實驗室細胞庫，RT-PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司，CCK-8試劑盒購于美國Sigma公司；兔抗人CD63、CD9和phalloidin單克隆抗體均購于美國Cell Signaling Technolog公司，β-actin單克隆抗體購于上海康成生物公司；胎牛血清、培養基購于美國Gibco公司；PKH67購于德國默克公司，Annexin-V/ Propidium Iodide試劑盒購自廣州康眾生物有限公司，RPMI1640和胎牛血清購自廣州益龍科技有限公司。共聚焦顯微鏡(德國萊卡公司)，H-7600電子顯微鏡(日本日立)。2%磷鎢酸購自美國Sigma，TRIzol LS試劑(Invitrogen，CA，USA)。

1.2 細胞培養與外泌體的提取

人源性膠質瘤細胞U251或人星型膠質細胞置于RPMI 1640 培養基中常規培養，添加青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml降低細胞污染，設定培養箱參數為37 ℃、95%飽和濕度，5% CO培養箱，每2～3天更換1次培養基，常規培養細胞72 h后，提取細胞上清液，4 ℃下完成離心操作，依次275 r/min離心8～10 min，提取離心管內上清液，1 836 r/min離心15 min，提取離心管內上清液，3 000 r/min離心30 min，用0.22 μm濾器過濾后，24 000 r/min離心60 min，去除離心管內上清液，用1 ml PBS吹打混勻管底，凍存于-80 ℃冰箱。

1.3 透射電鏡觀察外泌體形態

外體重懸液置于涂有碳涂層的300網銅網格上，然后在室溫下干燥5 min，用2%磷鎢酸滴染色10 min。采用H-7600電子顯微鏡觀察樣品形態，納米顆粒跟蹤分析(NTA)評估分離的外泌體直徑分布。

1.4 Western blot

實驗設U251細胞外泌體組和U251細胞去外泌體上清液組(對照組)，總蛋白提取后，用SDS-PAGE將等載量的提取蛋白分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜3 h，然后依次加入CD9、CD63和β-actin蛋白抗體(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜。PBS沖洗后滴加二抗(1 ∶2 000)，室溫下溫育2 h。滴加化學發光試劑(ECL)2 min，使用Chemi DocMP顯現。

1.5 免疫熒光染色

細胞PBS沖洗后，依次加入多聚甲醛溶液固定，0.1% Tirton X-100，BSA溶液封閉，按預設時間間隔加入PKH67熒光標記(綠色)(1 ∶100稀釋)，phalloidin抗體(1 ∶100稀釋)，U251細胞外泌體采用PKH67熒光標記(綠色)，U251細胞質用phalloidin染色，避光條件下孵育1 h，DAPI染核3 min，PBS沖洗后取出細胞爬片，封片，熒光顯微鏡下觀察。運用激光共聚焦顯微鏡采集圖像。圖像采用Image Pro軟件分析。

1.6 細胞增殖活力檢測

取處于對數生長期細胞，配置密度為1×10/ml細胞懸液，于96孔板中每孔加入單細胞懸液100 μl，空白孔加入等量的培養基，置于37 ℃、恒定飽和濕度、 5% CO培養箱中孵育，分別于培養第0、24、48、72及96 小時加入10 μl CCK-8溶液，繼續孵育3～4 h后，置于酶標儀用450 nm單波長測吸光度值(OD值)，實驗重復3次，繪制細胞生長曲線。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數生長期細胞，以2×10個/孔接種在6孔板上。按實驗設計分組培養后胰酶消化收集處理，PBS清洗后70%冷乙醇固定，離心洗滌后采用Annexin-V/ Propidium Iodide試劑盒檢測細胞凋亡比例。

1.8 MiRNAs基因篩選

選擇國內外文獻報道，已通過miRNAs基因芯片證實與U251膠質瘤細胞增殖凋亡相關20個miRNAs作為篩選目標：miR-4726-5p、miR -1255b-2-3p、miR -340-5p、miR -4275、miR -4712-3p、miR -576-5p、miR -1299、miR -4268、miR -3591-5p、miR -626、miR -3169、miR-374a、miR-590-3p、miR-374b、miR-29c、miR-125b、miR-221、miR-10a、miR-32和miR-138。

1.9 MiR-125b NC、mimics、inhibitor質粒轉染

實驗分對照組：轉染陰性對照組(negative control，NC)、miR-125b mimics組和miR-inhibitor組。miR-125b NC、mimics和inhibitor質粒載體由上海吉瑪生物制藥有限公司構建，將質粒載體轉染后，采用胰酶收集細胞，重懸沉淀后用細胞培養液將細胞密度調至5×10個/ml，接種于6孔板中培養。

1.10 RT-PCR

參照TRIzol試劑說明書操作提取細胞總RNA，鑒定RNA濃度及純度。采用RT-PCR試劑盒，按照上面反應體系進行cDNA的合成逆轉錄反應體系。ABI Prism7500型熒光定量 PCR儀中擴增，以內參U6進行標準化，采用2法計算基因的相對表達量。

2 結果

2.1 膠質瘤細胞源性外泌體的鑒定

透射電子顯微鏡結果顯示：膠質瘤U251細胞上清液提取出外泌體顆粒具有雙側膜結構(圖1A)，納米顆粒跟蹤分析顯示：外泌體的尺寸分布約為100 nm直徑(圖1B)。Western blot顯示：外泌體組特異性外泌體標記蛋白CD9和CD63含量高于對照組(去外泌體細胞上清液)(圖1C)。結果表明，外泌體成功地從細胞上清液中分離出來。

圖1 膠質瘤細胞源性外泌體的鑒定A：電鏡下外泌體形態(×50 000，紅色箭頭)；B：外泌體徑粒分析；C：外泌體標志性蛋白CD63和CD9表達量

2.2 U251細胞攝取外泌體情況

在U251細胞培養基中分別加入濃度為100 μg/ml的外泌體懸液30 μl(外泌體組)或等量不含外泌體培養基(對照組)，共聚焦熒光顯微鏡結果顯示：外泌體組U251細胞內可見PKH67熒光標記，對照組(細胞上清液)細胞內未見PKH67熒光標記(圖2)。

圖2 熒光顯微鏡下U251細胞攝取外泌體情況 ×400DAPI：U251細胞核；PKH67：外泌體；FITC-phalloidin：U251細胞質；Merge：合圖

2.3 外泌體影響U251細胞增殖凋亡

分別將外泌體懸液30 μl(濃度為100 μg/ml)或無外泌體培養基30 μl(對照組)加入U251細胞共培養，流式細胞術結果顯示：外泌體組細胞凋亡比例為(6.03±0.15)%，低于對照組(18.34±4.07)%(

t

=17.207，

P

<0.01)(圖3A)。CCK-8結果顯示：外泌體組細胞增殖活性在72 h(

t

=9.398，

P

<0.01)及96 h(

t

=6.025，

P

<0.01)時間點高于對照組對應時間點(圖3B)，差異有統計學意義(

P

<0.05)。

圖3 外泌體對U251細胞增殖凋亡的影響A：流式細胞法檢測細胞凋亡(Q2+Q3)比例；B：CCK-8檢測細胞在450 nm處吸光度值，與對照組比較：*P<0.05

2.4 膠質瘤細胞源性外泌體內miRNA的鑒定

按“1.8項下方法”選擇的20個miRNAs，RT-PCR結果顯示：U251細胞外泌體中miR-125b、miR-221、miR-374a、miR-138和 miR-4712等含量高于人星型膠質細胞外泌體。其中miR-125b倍數差異性最高(圖4)，差異有統計學意義(

t

=38.322，

P

<0.01)。

圖4 RT-PCR檢測miRNAs相對表達量與人星型膠質細胞外泌體比較：*P<0.05

2.5 外泌體通過miR-125b調控膠質瘤細胞的增殖凋亡

分別將miR-NC、miR-125b mimics或miR-125b inhibitor轉染U251細胞后提取外泌體，RT-PCR結果顯示：miR-NC組外泌體miR-125b水平高于miR-125b inhibitor組(

t

=2.533，

P

=0.039)，低于miR-125b mimics組(

t

=21.103，

P

<0.01)(圖5A)。將提取的外泌體與U251細胞共培養，CCK-8結果顯示：在72 h及96 h時間點，miR-NC組細胞增殖活性低于miR-125b mimics組(72 h，

t

=2.486，

P

=0.038)(96 h，

t

=2.636，

P

=0.030)，高于miR-125b inhibitor組(72 h，

t

=2.938，

P

=0.028)(96 h，

t

=2.815，

P

=0.021)(圖5B)。流式細胞術結果顯示miR-NC組細胞凋亡比例為(14.33±3.06)%，高于miR-125b mimics組(7.12±1.27)%(

t

=4.132，

P

=0.003)，低于miR-125b inhibitor組(32.75±5.41)%，差異均有統計學意義(

t

=6.198，

P

<0.01)(圖5C)。

圖5 外泌體通過miR-125b調控膠質瘤細胞的增殖凋亡A：RT-PCR檢測miR-125b相對表達量，與miR-NC組比較：*P<0.05，**P<0.01；B：CCK-8檢測細胞在450 nm處吸光度值，與miR-125b mimics比較：*P<0.05；與miR-125b inhibitor組比較：#P<0.05；C：流式細胞法檢測細胞凋亡(Q2+Q3)比例

3 討論

研究發現，外泌體是細胞外囊泡的常見類型，可作為蛋白質、RNAs和其他生物活性分子載體，參與膠質瘤細胞間的信號傳導，進而改變受體細胞的增殖、凋亡等。Spinelli et al發現人內皮細胞外泌體通過干擾膠質瘤干細胞的增殖及分化，促使膠質瘤干細胞保持多向分化能力及腫瘤特性。Hao et al發現星型膠質瘤細胞外泌體通過抑制受體細胞PTEN蛋白，促進腫瘤細胞增殖，減少細胞自然狀態下的凋亡比例。此外，Zhou et al總結指出，巨噬細胞、星型細胞等，均可通過外泌體完成細胞間的信號傳導，觸發反饋循環通路。本研究中發現，將膠質瘤細胞外泌體與腫瘤細胞共培養后，可增加細胞增殖活性；流式細胞術發現，外泌體與U251細胞共培養后，細胞晚期凋亡比例明顯降低，提示外泌體可調控細胞增殖凋亡活性。

在膠質瘤細胞微環境中，外泌體miRNAs是多種生理和病理條件下的細胞調節因子，通過激活和(或)抑制不同的信號通路，在膠質瘤增殖凋亡過程中發揮重要作用。如Yue et al提出，低氧條件下膠質瘤細胞外泌體通過miR-301a，靶向抑癌基因轉錄延伸因子A樣蛋白7，激活Wnt/catenin信號通路，調控膠質母細胞瘤的增殖活性。Yang et al發現膠質瘤細胞外泌體可通過miR-221，抑制受體細胞發動蛋白(DNM3)，促進細胞增殖。本研究對比人星型膠質細胞外泌體與膠質瘤細胞外泌體發現，多個miRNAs出現差異性表達，如miR-125b、miR-221、miR-10a、miR-32等，提示外泌體可根據細胞源性不同，調整RNAs轉錄。但同時也發現，PCR結果與以往文獻報道存在差異性，推測其可能原因是：miRNAs必須通過RNA結合蛋白RBPs運輸到多囊泡體，最終裝載到外泌體并從質膜分泌。在不同細胞源性及微環境下，外泌體中Argonaute 2蛋白的缺失程度不同，或外泌體miRNAs降解程度不一，均可導致miRNAs水平出現差異性變化。

研究發現，miR-125b在多個腫瘤細胞中表達含量明顯升高，其對應的靶基因眾多，覆蓋細胞增殖、分化、遷移、凋亡、細胞周期和耐藥等，但其作用存在差異性。如Zheng et al發現急性淋巴細胞白血病和低分化非小細胞肺癌中，miR-125b作為腫瘤增殖和細胞周期調控的抑制因子，通過調控NF-κB信號通路發揮作用。而Huang et al在膠質瘤細胞中發現，miR-125b的上調可激活Wnt通路，同時促進STAT3和NF-κB信號通路活性。此外，神經氨酸酶1、DRAM2、P53和P38均是miR-125b的直接靶點，miR-125b對下游靶基因的抑制程度直接影響細胞增殖活性。在本研究中，外泌體內miR-125b含量較高，明顯高于其他RNAs，將外泌體懸液與miR-125b inhibitor共同加入細胞共培養后，可逆轉外泌體對細胞增殖凋亡的影響，提示外泌體對膠質瘤細胞增殖凋亡的調控作用，主要依賴miR-125b。此外，本研究中，miR-125b促進膠質瘤細胞增殖，抑制凋亡，推測miR-125b可能通過P53和P38蛋白發揮作用。

本研究的局限性在于僅在U251細胞株進行驗證，在其他膠質瘤細胞株中的結果尚未證實；此外，外泌體是否可通過長鏈非編碼RNA、mRNAs或蛋白質等發揮作用仍需要進一步論證。