新生期小鼠七氟醚暴露對其青春期學習記憶及海馬組織髓鞘損傷的影響

張 意，楊志來，張繼千，劉學勝

全球每年有數百萬兒童在全麻下接受手術治療，但全麻藥物對兒童中樞神經系統的影響尚不明確。2016年FDA提出，3歲以下兒童和孕晚期孕婦，長時間或多次全麻藥物和鎮靜劑暴露可能會影響兒童的大腦發育，中樞神經系統髓鞘在學習及記憶中扮演重要角色，可能參與該過程。揮發性全麻藥物七氟醚可通過抑制海馬GSK3β/β-catenin信號通路中GSK3β的Ser9位點磷酸化進而損害成年大鼠記憶鞏固，該信號通路在髓鞘基因表達過程中發揮關鍵作用。該研究擬建立新生期小鼠多次七氟醚暴露模型，探究七氟醚暴露對小鼠海馬組織髓鞘損傷及青春期學習記憶功能的影響，并初步揭示GSK3β/β-catenin信號通路在其中的作用，為臨床兒童麻醉管理提供指導，降低七氟醚對兒童中樞神經系統的不良影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級8～10周C57BL/6小鼠，購自上海斯萊克生物有限公司，6日齡小鼠由繁殖獲得。動物生產許可證號：SCXK(滬)2017 - 0005。飼養條件為SPF級環境，溫度為(23±3) ℃，濕度為40%～70%，12 h/12 h明暗交替，自由飲水、攝食。

1.2 主要試劑與儀器

七氟醚(批號：20120931)購自上海恒瑞醫藥有限公司；氯化鋰(批號：310468)購自美國Sigma公司；MBP抗體(批號：10458-1-AP)購自Proteintech公司；pGSK3β抗體(批號：5558)、GSK3β抗體(批號：9327)、β-catenin抗體(批號：8480)購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體(批號：8226)購自英國Abcam公司。七氟醚揮發罐購自德國Drager公司。

1.3 分組與處理方法

6日齡C57BL/6小鼠隨機分成4組，即對照組(CON組)、七氟醚組(SEVO組)、對照+氯化鋰組(LiCl組)、七氟醚+氯化鋰組(SEVO+LiCl組)。分子生物學實驗，每組小鼠5只，新物體識別實驗，每組小鼠15只，Y迷宮實驗，每組小鼠15只。SEVO組為3%七氟醚連續暴露3 d(第6～8天)，每天1次，每次2 h，CON組為60%氧氣對照，LiCl組為60%氧氣暴露前30 min腹腔注射GSK3β抑制劑氯化鋰(100 mg/kg)，SEVO+LiCl組為七氟醚暴露前30 min腹腔注射氯化鋰(100 mg/kg)，CON組與SEVO組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。第8天麻醉結束后取海馬組織進行分子生物學檢測。第30～32天進行新物體識別實驗及Y迷宮實驗。根據既往研究，在七氟醚暴露期間，60%氧氣可以使小鼠體內維持足夠氧分壓，本研究中，60%氧氣與40%氮氣混合作為載氣。監測七氟醚、氧氣和二氧化碳濃度。采用保溫裝置，使小鼠體溫維持在(37±0.5) ℃。氯化鋰溶液由氯化鋰粉末溶于0.9%無菌生理鹽水配置而成。

1.4 新物體識別實驗

實驗設計包含3個階段，即適應階段、獲取階段、測試階段。適應階段為在沒有任何物體的環境中適應10 min,然后將小鼠放回原先飼養籠；獲取階段為適應結束24 h，在原先適應的環境中放置兩個相同的物體(A+A)探索10 min，分別記錄探索兩個物體A的次數；測試階段為獲取結束后24 h，將環境中的一個物體A置換成另一個新的物體B,分別記錄探索物體A和物體B的次數。采用新物體識別實驗識別指數來評估海馬依賴的學習記憶功能。識別指數=(探索物體B次數-探索物體A次數)/(探索物體B次數+探索物體A次數)。

1.5 Y迷宮實驗

Y迷宮裝置由平行于水平面的3個臂組成，即起始臂、其它臂和新臂，相鄰兩臂之間夾角為120°。實驗設計包含2個階段，即獲取階段和測試階段。獲取階段封閉新臂入口，允許小鼠在起始臂和其它臂之間探索10 min，分別記錄進入起始臂和其它臂的次數。間隔2 h進入測試階段，該階段為Y迷宮裝置的3個臂均開放，將小鼠由起始臂放入，記錄5 min內進入新臂的次數和進入3個臂的總次數。采用Y迷宮實驗新臂探索次數百分比來評估海馬依賴的學習記憶功能。新臂探索次數百分比=( 新臂探索次數/3個臂總探索次數)×100%。

1.6 Western blot實驗

取小鼠海馬組織，加入組織裂解液RIPA及蛋白酶抑制劑PMSF，冰上超聲碎解后離心取上清液，BCA試劑盒測定總蛋白濃度。上樣到13.5% SDS-PAGE凝膠中電泳分離蛋白，電泳后將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜,5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗MBP(1 ∶1 000)、pGSK3β(1 ∶1 000)、GSK3β(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌，用標記辣根過氧化物酶的二抗室溫搖床孵育1 h，ECL顯影液觀察。在全自動凝膠成像系統中曝光顯影，并用Image J軟件統計灰度值，計算相對表達量。

2 結果

2.1 新生期小鼠七氟醚暴露致青春期學習記憶功能受損

通過新物體識別實驗和Y迷宮實驗，評估小鼠出生后早期七氟醚暴露導致的青春期學習記憶功能損傷。在新物體識別實驗中，與CON組(0.21±0.10)比較，SEVO組(0.10±0.07)小鼠識別指數明顯降低，差異有統計學意義(

t

=3.156 ,

P

<0.05)，見圖1A。在Y迷宮實驗中，與CON組(47.01±3.40)% 比較，SEVO組(32.15±5.49)% 小鼠新臂探索次數百分比降低，差異有統計學意義(

t

=7.718 ,

P

<0.05)，見圖1B。

圖1 新生期小鼠3%七氟醚多次暴露對其青春期學習記憶能力影響A:新物體識別實驗檢測兩組小鼠第30～32天時識別指數；B:Y迷宮實驗檢測兩組小鼠第30～32天時新臂探索次數百分比；與CON組比較 ：*P<0.05

2.2 新生期小鼠七氟醚暴露導致海馬組織髓鞘損傷

Western blot檢測小鼠海馬組織髓鞘相關蛋白MBP表達及GSK3β/β-catenin信號通路蛋白變化。與CON組比較，SEVO組小鼠海馬組織MBP蛋白、β-catenin蛋白表達降低，pGSK3β/GSK3β比值降低，差異有統計學意義(MBP:

t

=4.692；pGSK3β/GSK3β:

t

=3.381;β-catenin:

t

=2.993,均

P

<0.05)，見圖2A～F。

圖2 新生期小鼠3%七氟醚多次暴露后小鼠海馬組織中MBP蛋白表達、pGSK3β/GSK3β比值、β-catenin蛋白表達變化A:MBP和β-actin的免疫印跡條帶；B:MBP蛋白灰度值標準化后的統計結果；C:pGSK3β和GSK3β的免疫印跡條帶；D:pGSK3β蛋白和GSK3β蛋白灰度值比值標準化后的統計結果；E:β-catenin和β-actin的免疫印跡條帶; F:β-catenin蛋白灰度值標準化后的統計結果;與CON組比較 ：*P<0.05

2.3 七氟醚可能通過抑制海馬GSK3β/β-catenin信號通路中GSK3β磷酸化引起新生期小鼠七氟醚暴露后的海馬組織髓鞘損傷

Western blot結果表明，與SEVO組比較，SEVO+LiCl組小鼠海馬組織MBP蛋白、β-catenin蛋白表達增加，pGSK3β/GSK3β比值升高，差異有統計學意義(MBP:

F

=6.589; pGSK3β/GSK3β:

F

=9.898;β-catenin:

F

=8.122,均

P

<0.05)，見圖3A～F。

圖3 七氟醚暴露前30 min腹腔注射氯化鋰后對小鼠海馬組織中MBP蛋白表達、pGSK3β/GSK3β比值、β-catenin蛋白表達變化A:MBP和β-actin的免疫印跡條帶；B:MBP蛋白灰度值標準化后的統計結果；C:pGSK3β和GSK3β的免疫印跡條帶；D:pGSK3β蛋白和GSK3β蛋白灰度值比值標準化后的統計結果；E:β-catenin和β-actin的免疫印跡條帶;F:β-catenin蛋白灰度值標準化后的統計結果;1：CON組；2：SEVO組；3：LiCl組；4：SEVO+LiCl組；與CON組比較：*P<0.05 ；與SEVO組比較：#P<0.05

2.4 氯化鋰減輕新生期小鼠七氟醚暴露后的學習記憶功能損傷

新物體識別實驗結果顯示，與SEVO組(0.08±0.07)比較，SEVO+LiCl組(0.23±0.11)小鼠識別指數升高，差異有統計學意義(

F

=6.921，

P

<0.05)，見圖4A。Y迷宮實驗結果顯示，與SEVO組(33.63±6.39)%比較，SEVO+LiCl組(45.03±3.55)%小鼠新臂探索次數百分比升高，差異有統計學意義(

F

=24.816，

P

<0.05)，見圖4B。

圖4 七氟醚暴露前30 min腹腔注射氯化鋰后對小鼠青春期學習記憶能力影響A:新物體識別實驗檢測四組小鼠第30～32天時識別指數；B:Y迷宮實驗檢測兩組小鼠第30～32天時新臂探索次數百分比；1：CON組；2：SEVO組；3：LiCl組；4：SEVO+LiCl組；與CON組比較：*P<0.05 ；與SEVO組比較：#P<0.05

3 討論

七氟醚具有刺激小、誘導平穩、蘇醒快等優點，廣泛應用于臨床兒科手術中，但其對兒童神經系統是否有影響目前還存在爭議。2019年《柳葉刀》雜志上發表了一項關于全麻藥物神經發育毒性的前瞻性隨機對照研究(GAS研究)，結果顯示接受短時間七氟醚麻醉與接受局部麻醉的幼兒比較，在2歲和5歲時的智商分數及其他神經認知功能無顯著差異。近期，PANDA、MASK兩項關于全麻藥物神經發育毒性的臨床回顧性研究表明，嬰幼兒早期短暫接觸全麻藥物對神經系統的發育無明顯影響，但多次全麻藥物暴露會降低運動協調能力?；谂R床研究中發現的不同結果，全麻藥物對中樞神經系統的影響有待進一步的探索。大量動物研究表明，幼鼠多次全麻藥物暴露會導致后期認知功能障礙，其機制可能與神經元凋亡、再生抑制及突觸功能障礙有關。本研究在動物水平上分析了七氟醚對小鼠學習記憶功能的影響。為模擬臨床兒童麻醉暴露，選擇出生后第6～8天七氟烷暴露，第30～32天檢測小鼠的學習記憶功能。采用的是目前廣泛應用于動物海馬依賴認知功能分析的新物體識別實驗和Y迷宮實驗。與CON組比較，SEVO組小鼠識別指數下降、新臂探索次數百分比降低，表明小鼠學習記憶功能受損，該結果與此前發表的研究結果一致。

中樞神經系統髓鞘在學習和記憶中發揮重要作用，且髓鞘易受外界影響。Zhang et al提出七氟醚通過增加非靈長類動物和嚙齒動物髓鞘發育相關基因ERMN啟動子區甲基化水平，造成發育中的幼鼠大腦葉酸代謝紊亂引起髓鞘損傷，最終導致小鼠認知功能障礙，該研究提示髓鞘損傷可能是全麻藥物神經毒性的機制之一。近期有研究表明海馬組織的髓鞘損傷與認知功能損害有關。而本研究Western blot結果顯示，與CON組比較，SEVO組小鼠海馬組織髓鞘堿性蛋白MBP降低，新物體識別指數下降，新臂探索次數百分比降低，表明七氟醚暴露后小鼠海馬組織存在髓鞘損傷及學習記憶功能損害。

本課題組前期研究表明七氟醚可抑制成年大鼠海馬GSK3β/β-catenin信號通路中GSK3β的磷酸化。GSK3β/β-catenin信號通路在髓鞘基因表達和髓鞘發生過程發揮重要作用。本研究結果顯示，新生期小鼠七氟醚暴露可以抑制海馬組織GSK3β的磷酸化。與CON組比較，SEVO組小鼠pGSK3β/GSK3β比值降低，引起下游β-catenin蛋白表達下降。采用GSK3β抑制劑氯化鋰預處理后，小鼠海馬組織pGSK3β/GSK3β比值升高，逆轉GSK3β/β-catenin信號通路中GSK3β磷酸化的抑制，小鼠海馬組織髓鞘蛋白MBP及β-catenin蛋白表達增加。行為學結果也表明，SEVO+LiCl組小鼠識別指數和新臂探索次數百分比增加，相對于SEVO組小鼠學習記憶功能有所好轉。

綜上所述，新生期小鼠多次七氟醚暴露后，GSK3β/β-catenin信號通路中的GSK3β磷酸化受到抑制，導致海馬組織髓鞘損傷，引起青春期的學習記憶功能損傷，通過氯化鋰預處理，減輕七氟醚對兒童中樞神經系統的毒副作用，為臨床兒童麻醉提供指導。