抑制p38MAPK信號通路對尿源性膿毒血癥兔腎組織細胞凋亡的影響及其作用機制

唐亞純，許武軍，陳 仙，吳孝斌，符 浩

膿毒癥是一種常見的由感染引起的全身炎癥反應綜合征，可導致機體重大臟器功能障礙。在多種感染途徑中，尿路感染約占嚴重膿毒癥病例的9%，常見于與臨床醫療相關的尿路感染，包括因尿路干預和前列腺活檢導致的尿源性膿毒癥。研究發現，上尿路感染的患者發生患腎功能衰竭的風險更高。腎組織細胞凋亡是尿源性膿毒癥的病理生理學的核心表現，因此抑制腎細胞凋亡對保護尿源性膿毒癥患者腎功能尤為重要。p38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一種應激激活蛋白激酶，對細胞存活和增殖具有負性調節作用。前期研究顯示，HS能夠通過抑制腎組織中p38 MAPK蛋白的磷酸化激活而減少尿源性膿毒血癥兔腎組織細胞凋亡，但p38 MAPK信號通路的抑制又是如何介導尿源性膿毒血癥兔腎組織細胞凋亡目前還未知。作為抑癌基因，p53可通過參與誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期進程等生物學過程發揮作用。有研究顯示，p38 MAPK能夠通過介導小鼠雙微體擴增(murine double minute 2，MDM2)蛋白降解而促進p53表達，而p53介導的細胞凋亡途徑是細胞凋亡的重要途徑之一。因此，該研究通過觀察p38 MAPK抑制劑SB203580對尿源性膿毒癥新西蘭兔腎功能以及腎組織凋亡情況的影響，探討p38 MAPK介導腎細胞凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只健康雄性新西蘭兔購自湖南太平生物科技有限公司，體質量2.0～2.4 kg，實驗動物生產許可證：SCXK(湘)2015-0004。標準顆粒飼料及純凈水喂養，鐵籠邊放飼料槽及自由飲水管，濕度 50%～60%，室溫 20～25 ℃。

1.2 主要試劑與儀器

大腸埃希菌菌液購自美國ATCC(25922)，由南華大學附屬第二醫院檢驗科保存。p53激活劑Nutlin-3購自美國Selleckem公司；p38 MAPK抑制劑SB203580購于美國MedChemExpress公司；血清白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量檢測ELISA試劑盒購自南京森貝伽生物科技公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色FITC標記熒光)購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；PrimeScript RT試劑盒和TB Green? Premix Ex TaqⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司；鼠抗人MDM2抗體、鼠抗人p53抗體、鼠抗人PUMA抗體購自美國Santa Cruze Biotechnology公司；兔抗人Cleaved caspase-3抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人p-p38MAPK(Thr180/Tyr182) 抗體、兔抗人p38MAPK抗體和兔抗人GAPDH抗體購自英國Abcam公司；480熒光定量PCR儀購自美國羅氏公司；Gel Doc XR凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；全自動血細胞分析儀購自深圳庫貝爾生物科技股份有限公司；全自動生化分析儀購自德國西門子公司。

1.3 方法

1.3.1

尿源性膿毒血癥模型構建與動物分組 采用30 mg/kg戊巴比妥靜脈注射麻醉新西蘭兔，取左肋緣最低點作切口(3 cm)，在后腹腔找到左腎及輸尿管，游離輸尿管上段，用1號絲線結扎輸尿管遠端，按0.5 ml/kg在輸尿管近端注入10cfu/ml大腸埃希菌菌液，制備尿源性膿毒血癥兔模型，術后正常喂養。采用隨機數字表法將60只新西蘭兔分成4組，每組15只。假手術組(sham)：按尿源性膿毒血癥模型構建的步驟，游離輸尿管上段后，立刻縫合切口，術后正常喂養；尿源性膿毒血癥組(Model)：按尿源性膿毒血癥模型構建步驟進行處理；p38MAPK抑制劑SB203580處理組(SB203580)：在尿源性膿毒血癥組的基礎上，造模前30 min給予30 μg/kg SB203580溶液靜脈注射，1次/d，干預3 d；SB203580+p53激活劑Nutlin-3組(SB203580+Nutlin-3)：在注射SB203580溶液同時，給予128 mg/kg Nutlin-3溶液腹腔注射，1次/d，干預3 d。

1.3.2

大體觀察 分別記錄造模后24、48 和72 h 時各組新西蘭兔的肛溫、呼吸頻率、心率等情況變化。

1.3.3

血清指標檢測 在造模后72 h取新西蘭兔的耳動脈血，利用全自動血液細胞分析儀進行白細胞計數(white blood cell，WBC)；全自動生化分析儀檢測腎功能指標血肌酐、尿素氮的水平；利用ELISA試劑盒檢測血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.3.4

TUNEL染色觀察腎組織細胞凋亡水平 造模后72 h取腎組織進行常規石蠟切片，經脫蠟至水，根據TUNEL染色試劑盒操作步驟進行染色后，置于熒光顯微鏡下觀察腎組織細胞凋亡情況。

1.3.5

qRT-PCR法檢測腎組織MDM2和p53 mRNA表達水平 造模后72 h取適量腎組織，使用TRIzol試劑提取總RNA。用PrimeScript RT試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，再利用TB Green? Premix Ex TaqⅡ試劑盒進行PCR擴增檢測。目的基因相對表達量用2公式計算得出。PCR引物序列MDM2-F：5′-CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT-3′，MDM2-R：5′-AGACGTTCAGTCCTGTCC ATAA-3′；p53-F：5′-ACAGAAACACCTTCCGACAC-3′，p53-R：5′-CCTGGGCATC CTTTAGCT-3′；GAPDH-F：5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，GAPDH-R：5′-CGCTCCTG GAAGATGGTGAT-3′。

1.3.6

Western blot法檢測腎組織凋亡、p38MAPK信號通路和p53凋亡途徑相關蛋白表達水平 造模72 h后取適量腎組織，加入液氮后充分研磨，RIPA細胞裂解液溶解，置冰上30 min，4 ℃ 13 000 r/min離心10 min，取上清液。用BCA測定蛋白質濃度，取30 μg總蛋白，于12%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，轉移到PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入Cleaved caspase-3(1 ∶2 000)、Bax(1 ∶2 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、p38 MAPK(1 ∶1 000)、p-p38 MAPK(1 ∶4 000)、MDM2(1 ∶500)、p53(1 ∶200)、PUMA(1 ∶100)和GAPDH(1 ∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入相應的辣根過氧化物酶標記的第二抗體，室溫孵育2 h，ECL試劑顯色，曝光成像，掃描圖像。用Quantity One V6.42軟件對每個條帶的灰度值進行分析，以同一樣本中每個靶帶的灰度值與GAPDH條帶灰度值之比作為目標蛋白的定量結果。

2 結果

2.1 抑制p38MAPK信號通路對兔大體觀察的影響

與sham組比較，Model組造模后24、48和72 h兔肛溫、呼吸頻率和心率均上升(

P

<0.05)；與Model組比較，SB203580組造模后24、48和72 h兔肛溫、呼吸頻率和心率降低(

P

<0.05)；與SB203580組比較，SB203580+Nutlin-3組造模后24、48和72 h兔肛溫、呼吸頻率和心率上升(

P

<0.05)。見表1。

表1 各組兔肛溫、呼吸頻率和心率比較

2.2 抑制p38MAPK信號通路對兔血WBC和炎癥因子指標變化的影響

與sham組比較，Model組兔血WBC、血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均上升(

P

<0.05)；與Model組比較，SB203580組兔血WBC、血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低(

P

<0.05)；與SB203580組比較，SB203580+Nutlin-3組兔血WBC、血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平上升(

P

<0.05)。見表2。

表2 各組兔血白細胞計數和細胞炎癥因子水平比較

2.3 抑制p38MAPK信號通路對兔腎功能的影響

與sham組比較，Model組兔肌酐和尿素氮水平均上升(

P

<0.05)；與Model組比較，SB203580組兔肌酐和尿素氮水平降低(

P

<0.05)；與SB203580組比較，SB203580+Nutlin-3組兔肌酐和尿素氮水平上升(

P

<0.05)。見表3。

表3 各組兔腎功能指標血清比較

2.4 抑制p38MAPK信號通路對兔腎組織凋亡情況的影響

4組兔腎組織細胞凋亡蛋白Cleaved caspase-3(

F

=531.70，

P

<0.01)、Bax(

F

=254.51，

P

<0.01)和Bcl-2(

F

=471.40，

P

<0.01)表達水平有變化，差異有統計學意義。與sham組比較，Model組兔腎組織細胞凋亡水平，Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達水平上升，Bcl-2蛋白表達水平降低(

P

<0.05)；與Model組比較，SB203580組兔腎組織細胞凋亡水平，Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平增加(

P

<0.05)；與SB203580組比較，SB203580+Nutlin-3組兔腎組織細胞凋亡水平，Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達水平上升，Bcl-2蛋白表達水平降低(

P

<0.05)。見圖1、2。

圖1 TUNEL染色觀察兔腎組織凋亡情況 ×2001：sham組；2：Model組；3：SB203580組；4：SB203580+Nutlin-3組

2.5 抑制p38MAPK信號通路對兔腎組織p38MAPK蛋白表達的影響

4組兔腎組織p-p38MAPK蛋白表達水平有變化，差異有統計學意義(

F

=245.10，

P

<0.01)，而p38MAPK蛋白表達水平無變化(

F

=0.20，

P

=0.89)。與sham組比較，Model組兔腎組織p-p38MAPK蛋白表達水平升高(

P

<0.05)；與Model組比較，SB203580組兔腎組織p-p38MAPK蛋白表達水平降低(

P

<0.05)；與SB203580組比較，SB203580+Nutlin-3組兔腎組織p-p38MAPK蛋白表達水平無差異(

P

>0.05)。見圖3。

圖2 兔腎組織凋亡相關蛋白表達水平比較1：sham組；2：Model組；3：SB203580組；4：SB203580+Nutlin-3組；與sham組比較：*P<0.05；與Model組比較：#P<0.05；與SB203580組比較：&P<0.05

圖3 兔腎組織p38MAPK蛋白表達水平比較1：sham組；2：Model組；3：SB203580組；4：SB203580+Nutlin-3組；與sham組比較：*P<0.05；與Model組比較：#P<0.05

2.6 抑制p38MAPK信號通路對兔腎組織p53介導的凋亡途徑的影響

4組兔腎組織MDM2 mRNA和蛋白表達水平有變化，差異有統計學意義(

F

=303.30，

P

<0.01；

F

=223.75，

P

<0.01)；p53 mRNA和蛋白表達水平有變化，差異有統計學意義(

F

=2 092.05，

P

<0.01；

F

=469.62，

P

<0.01)；PUMA蛋白表達水平有變化，差異有統計學意義(

F

=122.80，

P

<0.01)。與sham組比較，Model組兔腎組織MDM2 mRNA和蛋白表達水平降低，p53 mRNA和蛋白表達水平，PUMA蛋白表達水平升高(

P

<0.05)；與Model組比較，SB203580組兔腎組織MDM2 mRNA和蛋白表達水平升高，p53 mRNA及p53、PUMA蛋白表達水平降低(

P

<0.05)；與SB203580組比較，SB203580+Nutlin-3組兔腎組織MDM2 mRNA和蛋白表達水平無變化(

P

>0.05)，p53 mRNA及p53、PUMA蛋白表達水平升高(

P

<0.05)。見圖4。

圖4 兔腎組織p53介導的凋亡途徑相關mRNA和蛋白表達水平比較A：qRT-PCR檢測腎組織中p53和MDM2 mRNA表達水平；B：Western blot檢測腎組織中MDM2，PUMA和p53蛋白表達水平；1：sham組；2：Model組；3：SB203580組；4：SB203580+Nutlin-3組；與sham組比較：*P<0.05；與Model組比較：#P<0.05；與SB203580組比較：&P<0.05

3 討論

膿毒癥綜合征是機體對感染的復雜炎癥反應，病死率高，是非心臟重癥監護患者死亡的主要原因之一。但在日常臨床體檢中常常無法及時監測到早期膿毒癥。尿源性膿毒癥是一種嚴重的、危及生命的泌尿系感染并發癥，死亡率非常高，因此，迅速發現尿源性膿毒癥并開始適當的治療十分重要。當外界感染刺激機體免疫系統如Toll樣受體等，會導致大量促炎性細胞因子(如IL-1和IL-6)分泌。在初始促炎階段之后，會出現一個反調節的抗炎反應，導致免疫抑制狀態。目前，尿源性膿毒癥所致的腎損傷機制尚不清楚，大多數普遍認為，血流動力改變、炎癥介質、免疫抑制和細胞凋亡與機體功能紊亂密切相關，其中炎癥介質是核心因素。因此本研究從炎癥介質和細胞凋亡探討尿源性膿毒癥所致腎損傷的可能機制理論上可行。本研究結果表明，尿源性膿毒癥新西蘭兔肛溫、呼吸頻率、心率、血WBC、血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高，說明尿源性膿毒癥兔體內炎癥反應加劇。已有研究證實，尿源性膿毒癥后出現的腎損傷并發癥可能是通過炎癥因子誘導腎細胞凋亡引起的。本研究結果表明，尿源性膿毒癥兔血肌酐、尿素氮含量、腎組織細胞凋亡水平增加，說明尿源性膿毒癥兔出現嚴重腎損傷。與之前的研究結果一致，提示尿源性膿毒癥新西蘭兔動物模型構建成功。

MAPK包括三大類：p42/44細胞外信號調節D激酶(ERK)，c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38激酶。p38MAPK信號通路作為MAPK家族中的重要組成部分，在炎癥、細胞應激、凋亡和細胞周期等多種生理病理過程中具有重要作用。已有研究證明，山楂葉總黃酮通過下調糖尿病腎病大鼠腎組織p38MAPK信號通路活性，改善氧化應激對腎組織的損傷。另有研究發現，p38MAPK通路在膿毒癥新生大鼠腦組織中異常激活，誘導腦組織炎癥、氧化應激和細胞凋亡。采用p38MAPK信號通路抑制劑SB203580干預后，腦組織炎癥、氧化應激和細胞凋亡情況均被逆轉。SB203580是p38MAPK的一種有效抑制劑，廣泛應用于各種實驗動物模型。SB203580通過與p38MAPK上的ATP結合位點結合抑制p38MAPK活性，阻止下游靶點磷酸化，但不能改變p38MAPK的表達水平。本研究結果表明，SB203580能逆轉尿源性膿毒癥兔各檢測指標，并且有效抑制腎組織磷酸化p38MAPK水平，但對p38MAPK本底蛋白表達水平無影響，驗證了p38MAPK抑制劑SB203580對p38MAPK磷酸化的抑制作用。

p53作為腫瘤抑制蛋白，通過轉錄調控下游靶基因參與細胞周期和凋亡過程。p53激活后，通過激活促凋亡基因(如Bax)誘導細胞凋亡，同時，還能與抗凋亡線粒體蛋白(如Bcl-2)結合直接誘導細胞凋亡。研究發現，膿毒癥大鼠腎組織細胞凋亡率升高，細胞促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase-3相對表達量升高，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達量降低。膿毒癥腎損傷通過caspase-3誘導細胞凋亡，且呈時間依賴性。研究證明，膿毒血癥組的腎組織凋亡細胞集中成團，凋亡細胞布滿整個視野，凋亡指數高于假手術組。這些研究說明，膿毒癥誘導腎組織細胞凋亡。已有研究證實，調節p53蛋白降解的分子是MDM2。MDM2是p53的典型E3泛素連接酶，也是p53靶基因之一。p38MAPK誘導p53磷酸化導致其與MDM2脫節，從而避免泛素蛋白酶體降解，表明p38MAPK以翻譯后方式調節MDM2和p53表達。目前，沒有研究清楚闡明p38MAPK如何介導MDM2的降解。p38MAPK可能直接磷酸化MDM2，導致其通過蛋白酶體途徑降解。另外，p38MAPK可能與其他分子相互作用來調節MDM2的穩定性。研究發現，MDM2活性的抑制提高了p53的穩定性，通過增強MDM2-E3連接酶活性促進p53降解。本研究結果表明，SB203580能上調MDM2表達水平，抑制p53和PUMA表達水平，加入p53激活劑Nutlin-3干預后，能逆轉SB203580干預后尿源性膿毒癥兔的各項檢測指標，但Nutlin-3只能上調腎組織PUMA 和p53的表達水平，無法調控MDM2和p-p38MAPK的表達水平，這是由于p53激活劑Nutlin-3的作用原理是與MDM2結合，進而抑制MDM2對p53蛋白的降解，與p53蛋白是競爭關系，因此無法調控其結合蛋白MDM2的表達水平，也對上游p-p38MAPK蛋白表達水平無影響。

綜上所述，在尿源性膿毒癥兔中，抑制p38MAPK信號通路能促進MDM2蛋白表達，誘導p53蛋白降解，進而抑制p53介導的腎細胞凋亡，緩解尿源性膿毒癥引起的腎損傷。