自組裝DEAC-PNAG@miR-150納米體系制備及其血管保護機制研究

李雅珺,許 航,任 珊

膿毒癥是重癥監護病房高死亡率的主要原因之一。膿毒癥可釋放大量炎癥因子，促進免疫細胞的活化和轉運。此外，膿毒癥常因內皮功能障礙擾亂微循環，導致器官衰竭。因此，減少膿毒癥患者體內相關炎癥因子的釋放、減輕內皮細胞損傷對于降低膿毒癥患者的死亡率大有裨益。微小RNA(mircoRNA,miRNA)能預防和修復膿毒癥患者體內細胞壓力和炎癥引起的內皮細胞損傷。miR-150是內皮細胞中表達的miRNA，對維持血管完整性和血管生成具有重要意義。核酸的一些理化性質限制其細胞攝取和潛在治療效果。因此，開發一種安全有效的miRNA載體對miRNA的治療具有重要意義。該研究通自組裝技術制備脫乙酰化聚N-乙酰氨基葡萄糖(DEAC-PNAG)-miRNAs納米聚合物并對其進行表征，檢測納米聚合物對miRNAs保護和靶向作用，并探討其發揮血管保護作用的相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫乙酰聚N-乙酰氨基葡萄糖(DEAC-PNAG)40 mg/ml(分子量約40 000)和無菌NaSO(50 mmol/L)購自阿拉丁公司(中國)；EBM-2基礎培養基，胎牛血清(FBS)、細胞培養基、青霉素鏈霉素溶液購自Sigma Aldrich(美國)；miR-150-5p(UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG)、miR-150-5p抑制劑從Genechem(中國)獲得；標記為hsa-miR-150-5p的Cy3購買自GE Healthcare Dharmacon(美國)；含DAPI的ExtendGold防褪色試劑(ThermoFisher Scientific，美國)；RT-PCR試劑盒購自Qiagen公司(美國)；人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購自BioVector公司(中國)；NIH3T3胚胎成纖維細胞購自Solarbio公司(美國)。

1.2 儀器與設備

5424R離心機(Eppendorf,德國)； JEOL-1010透射電子顯微鏡(美國);濱松C4742-95數碼相機(日本)；Zetasizer Nano-ZS 90(Malvern，英國)；UVP透照儀(Alpha Innotech Corporation，日本)；Synergy 4微板閱讀器(BioTek，美國)；Olympus IX73倒置顯微鏡(Olympus，日本)；CFX96實時PCR檢測系統(Bio-Rad，美國)。

1.3 納米顆粒制備

在室溫下向100 μl 濃度為50 mmol/L NaSO溶液中加入miR-150-5p(0.5～25.0 μg)，以研究封裝效率。添加1.1 mg的DEAC-PNAG后高速渦流20 s。隨后,添加NaCl,自組裝在室溫下反應15 min。使用NaOH中和納米聚合物混懸液，渦流10 s，最終pH值為7。通過15 000 r/min，4 ℃，離心1 h，分離納米顆粒備用。N/P采用以下公式計算：

N/P=(陽離子DEAC-PNAG×150胺基摩爾數)/(miRNA×44磷酸基團摩爾數)。

制備4種不同比例的DEAC-PNAG/miRNA，分別含有24.48、1.80、0.90和0.45 μg miRNA，比例為50 ∶1、700 ∶1、1 400 ∶1和2 700 ∶1。

1.4 DEAC-PNAG@miRNA表征

取DEAC-PNAG@miRNA混懸液離心，棄上清液。將納米顆粒重懸于TEM網格上。樣品在超純凈水中沖洗,干燥,TEM成像,DLS測定DEAC-PNAG納米聚合物的尺寸和Zeta電位。

1.5 電泳遷移率

用4%(W/V)瓊脂糖E-gel和iBase系統檢測DEAC-PNAG與miR-150的結合，向凝膠中添加20 μl 的納米聚合物樣品，iBase電泳按照制造商說明書實施。使用UVP透照儀分析miR-150條帶。

1.6 封裝效率

為評價DEAC-PNAG對miRNA的包封效率，用游離miRNA繪制標準曲線。不同濃度的miRNA在4%(W/V)瓊脂糖E-凝膠中用iBase系統電泳30 min。同時，使用4% SDS溶解凝膠中的納米聚合物。用Image J分析條帶，根據譜帶強度生成標準曲線，并根據標準曲線計算被包封的RNA濃度。

1.7 DEAC-PNAG@miRNA對miRNA保護作用

為評價DEAC-PNAG@miRNA對miRNA的保護作用。納米聚合物和游離miR-150在37 ℃下用0.18 μg RNase A處理1 h。15 000 r/min，25 ℃ 離心，棄上清液，用4 μl EDTA(0.25 mol/L)處理10 min。隨后將沉淀重新懸浮在2%十二烷基硫酸鈉中，在凝膠電泳前靜置30 min。處理后的納米聚合物和游離miRNA用4%(W/V)瓊脂糖E-凝膠在iBase系統中電泳30 min。

1.8 體外細胞實驗

1.8.1

細胞活力檢測 使用EBM-2基礎培養基，在37 ℃、5% CO孵箱中培養。培養基每48 h更換一次,第3～5代取用。在添加10% FBS的RPMI-1640培養基中培養。研究不同比例DEAC-PNAG@miRNA處理后HUVECs的存活率：miRNA納米聚合物用MTT法測定，在2.0×10個細胞/孔的96孔板中孵育。補充培養基，用不同N/P摩爾比的納米聚合物處理細胞。培養24 h后，洗滌細胞并加入MTT溶液。使用Synergy 4微板閱讀器在570 nm的吸光度處評估細胞活性。

1.8.2

細胞攝取 用Cy3標記的miRNA-150(Cy3-miRNA-150，紅色)攝取，細胞核用DAPI(藍色)復染。25 μl摩爾濃度分別為55.0、27.5和14.0 nmol/L納米聚合物處理HUVECs 24 h。去除聚合物，用PBS洗滌細胞，用4% PFA固定20 min。去除PFA后，使用含DAPI的ExtendGold防褪色試劑固定。熒光圖像通過Olympus IX73倒置顯微鏡獲得。

1.8.3

RT-PCR HUVECs細胞和NIH3T3細胞以1.0×10個細胞/孔的密度接種。讓細胞孵育過夜，隨后用25 μl納米聚合物處理24 h。用Mirnaesy試劑盒分離miRNA。使用Bio-Tek Gen5 Take 3 s軟件閱讀分析數據評估RNA完整性。通過miScript Ⅱ RT試劑盒，將1 μg miRNA合成cDNA。使用miScript-SYBR-Green-PCR試劑盒擴增cDNA產物。采用CFX96實時PCR檢測系統評估hsa-miR-150-5p的變化，以RNU6B為內參。

1.8.4

Western blot 血管緊張素-Ⅱ(Angiotensinogen-Ⅱ，Ang-Ⅱ):將接種在6孔板中的HUVECs(1×10個細胞/孔)與納米聚合物(50 ∶1)孵育24 h，納米聚合物每孔含有1.0 μg的陰性對照siRNA或miR-150。用EBM-2基礎培養基饑餓培養16 h，然后用LPS處理6 h或24 h。用含蛋白酶/磷酸酶抑制劑和岡田酸的RIPA緩沖液溶解。蛋白質裂解物在4%～12% Bis-Tris中在100～200 V下溶解1.5 h。轉置PVDF膜上1 h，用Odyssey封閉液阻斷1 h。用磷酸化Ang-Ⅱ(1 ∶1 000)和actin(1 ∶1 000)4 ℃過夜，用Odyssey-Licor成像系統分析印跡。

DLK-1:將接種在6孔板中的HUVECs與含有1.0 μg 陰性對照siRNA或miR-150-5p的納米聚合物以50 ∶1的比例培養48 h。提取細胞蛋白按上述方法裂解產物。印跡法α-微管蛋白(1 ∶1 000)或DLK-1(1 ∶1 000)4 ℃下過夜和IRDye二抗(1 ∶10 000)孵育1 h。

2 結果

2.1 DEAC-PNAG@miRNA的制備及對miRNA保護作用

由于非特異性抗菌特性，本研究選用DEAC-PNAG作為miRNAs的傳遞系統。通過瓊脂糖凝膠電泳遷移率變化分析，確定DEAC-PNAG結合miRNA的有效性。結果表明，N/P在50 ∶1～2 700 ∶1的配比范圍內，miRNA可完全與DEAC-PNAG結合(圖1A)。不同N/P的DEAC-PNAG@miRNA和游離miRNA分別與RNase A共培養60 min后，N/P為700 ∶1和1 400 ∶1觀察到少量的miRNA降解，而在N/P2 700 ∶1的聚合物中觀察到miRNA的大量降解(圖1B)。在N/P為700 ∶1時，約80%的miRNA被封裝，而在1 400 ∶1和2 700 ∶1的比率下，僅有約50%的miRNA被封裝(圖1C、D)。

圖1 DEAC-PNAG對miRNA-150的保護作用及封裝效率A：DEAC-PNAG對miRNA-150的凝膠阻滯作用；B：不同N/P納米聚合物對miRNA的保護作用；C：不同濃度游離miRNA(2、4～8道)，不同N/P納米聚合物顯示在9～12道；D：封裝效率柱狀圖

2.2 細胞攝取及細胞活力檢測

為證實納米聚合物促進HUVECs的細胞攝取，本研究制備熒光標記的DEAC-PNAG@Cy3-miRNA-150聚合物。該聚合物處理HUVECs 24 h后，通過熒光顯微鏡分析聚合物的亞細胞定位(圖2)。在N/P為700 ∶1、1 400 ∶1和2 700 ∶1 三組中觀察Cy3陽性細胞，而僅用Cy3-miRNA-150孵育的細胞中沒有Cy3熒光(圖2A)。陽離子聚合物可以影響細胞代謝活性和活力，因此我們使用MTT比色法確定DEAC-PNAG@miR-150的細胞代謝活性。使用N/P為700 ∶1、1 400 ∶1和2 700 ∶1的DEAC-PNAG@miR-150處理HUVECs 24 h，以未添加樣品正常培養的細胞為參照。結果表明對照組和實驗組間未觀察到細胞代謝活性的顯著差異(圖2E)。

圖2 DEAC-PNAG@ miR-150體外細胞細胞攝取及細胞活力A：DEAC-PNAG@Cy3-miRNA-150(0 ∶1)；B：DEAC-PNAG@Cy3-miRNA-150 (700 ∶1)；C：DEAC-PNAG@Cy3-miRNA-150(1 400 ∶1)； D：DEAC-PNAG@Cy3-miRNA-150 (2 700 ∶1)； E：HUVECs與DEAC-PNAG單獨或與不同比例miRNA復合培養24 h后的細胞代謝活性

2.3 DEAC-PNAG@miRNA表征

TEM成像結果顯示N/P 700 ∶1的納米聚合物呈圓形或橢圓形，且單分散(圖3A)。基于DLS分析，N/P 700 ∶1納米聚合物的平均粒徑約為254 nm(圖3B)。700 ∶1納米顆粒的Zeta電位為+16.4 mV，多分散指數(PDI)為0.479，表明納米顆粒的分散性較高。

圖3 TEM和DLS分析納米顆粒A:N/P 700 ∶1的納米聚合物TEM結果；B:N/P 700 ∶1的納米聚合物的粒徑分布

2.4 RT-PCR和Western bloting

為進一步量化納米聚合物處理HUVECs后miRNA的遞送，我們進行了RT-PCR試驗。與對照組和DEAC-PNAG單獨應用比較，DEAC-PNAG@miR-150聚合物增加HUVECs細胞中miR-150的表達(圖4A、B)。隨后進一步研究miRNA在miR-150表達水平較低的NIH3T3細胞中的遞送。結果用DEAC-PNAG@miR-150納米聚合物培養的NIH3T3細胞miR-150表達量增加3 772倍(圖4B)。以上數據表明DEAC-PNAG聚合物可以有效地遞送miRNAs以提高其細胞表達量。

圖4 聚合物轉染24 h后細胞中miR-150的表達水平A：聚合物轉染24 h后HUVECs 中miR-150水平實時PCR分析；B：聚合物轉染24 h后NIH3T3中miR-150水平的實時PCR分析;1：對照組； 2：DEAC-PNAG組; 3：miR-150-5p組；4：DEAC-PNAG@miR150-5p組

Western Blot檢測結果顯示，使用N/P 50 ∶1的納米聚合物具有體外生物效應(圖5A、C)，并能有效抑制RNase A降解(圖5B)。與DEAC-PNAG@NsiRNA比較，DEAC-PNAG@miR-150納米聚合物顯著抑制了HUVECs細胞內Ang-Ⅱ和DLK-1表達(

P

<0.05)(圖5A、C)。

圖5 DEAC-PNAG@miRNAs 50 ∶1聚合物對Ang-Ⅱ和DLK-1蛋白表達抑制作用A：HUVECs中Ang-Ⅱ的表達;B：N/P 50 ∶1的DEAC-PNAG@miRNAs對miRNA的保護作用;C：HUVECs中DLK-1的表達；與DEAC-PNAG@NsiRNA(50 ∶1)組比較：*P<0.05, **P<0.01

3 討論

由于基因的不穩定性，miRNA治療需引入有效的載體平臺將其導入細胞。病毒、脂質體和殼聚糖等載藥系統已被應用于miRNA負載。由于制備流程復雜，體內外核酸遞送效率低，應用價值有限。為降低上述限制，我們通過自組裝技術制備了DEAC-PNAG@miRNA自組裝聚合物，該聚合物可有效遞送miRNA至HUVECs和NIH3T3細胞中。RT-PCR結果顯示，DEAC-PNAG@miRNA-150納米聚合物可顯著提高miR-150細胞內表達水平。

DEAC-PNAG聚合物具有抗菌作用，是遞送用于膿毒癥治療miRNA的理想載體。Vournakis et al的研究表明，聚N-乙酰氨基葡萄糖(sNAG)納米纖維(DEAC-PNAG的類似物)，在傷口愈合過程中發揮抗菌作用。他們特別指出，sNAG可增強內皮細胞和角質形成細胞中α-防御素和β-防御素的表達，減少金黃色葡萄球菌的感染概率。此外，本研究證實作為治療膿毒癥miRNA載體，DEAC-PNAG能有效地包埋miRNA并保護其不被RNase降解，這點對于保證miRNA在體內環境中的穩定性至關重要。此外，納米聚合物直徑(約200 nm)允許其在循環過程中避免被肝臟和網狀內皮系統吸收，而其陽離子Zeta電位表明其具有良好的穩定性。

DEAC-PNAG@miRNA-150聚合物能有效地將miRNA傳遞給細胞，導致細胞功能性改變。細胞內傳遞的miRNA水平與細胞類型有相關性，我們研究結果證實了這一點。HUVECs的miR-150表達水平的增加明顯低于3T3成纖維細胞。這可能是細胞特異性給藥效率不同，也可能是由于內皮細胞中miR-150的表達水平高于成纖維細胞所致。盡管700 ∶1的納米聚合物有最佳的miRNA保護作用，但體外數據表明該濃度在細胞內不能產生最佳miRNA活性。可能該濃度會阻礙miRNA從納米聚合物中釋放，導致miRNA功能受損。此外，50 ∶1濃度DEAC-PNAG@miRNA-150可往細胞內遞送完整的miRNA，同時允許miRNA從聚合物中分離，繼而抑制Ang-Ⅱ和DLK-1的翻譯。

眾所周知，Ang-Ⅱ可引起血管通透增加，過量的Ang-Ⅱ生成與膿毒癥患者死亡率升高關系密切。miR-150能通過沉默包含互補序列的mRNA調節信號網絡，抑制Ang-Ⅱ生成，從而減輕血管損傷。DLK1可通過NOTCH1的激活抑制內皮細胞增殖，從而抑制血管生成。DEAC-PNAG@miRNA-150對二者的抑制，將有助于降低血管通透性，促進血管內皮細胞再生，從而促進血管發揮組織屏障作用。上述作用對于提升膿毒癥患者的生存率具有重要意義。未來研究中我們將進一步探討納米聚合物對膿毒癥小鼠存活率、膿毒癥內皮功能障礙和血管通透性的影響。重點監測50 ∶1納米聚合物，由于50 ∶1納米聚合物含有更多的miRNA，尚需確定是否存在劑量反應。此外，使用αvβ3整合素配體LXW7修飾或RGD肽將有助于提高納米聚合物靶向作用，miR-150對膿毒癥微環境中內皮功能的影響也有待進一步探討。

DEAC-PNAG聚合物是一種可行的miRNAs載體，DEAC-PNAG@miRNA-150納米粒子聚合物提高了miRNAs穩定性和細胞攝取，允許miRNA從聚合物中分離并抑制Ang-Ⅱ和DLK-1基因翻譯。這些研究表明DEAC-PNAG作為miR-150載體的可行性，為膿毒癥小鼠存活率及其血管保護的體內研究奠定基礎。