脂質(zhì)體莪術(shù)醇聯(lián)合順鉑抗人卵巢癌細(xì)胞作用和機(jī)制研究

張銘勛，張晨晨，蔡澤宇，宋永紅，吳 強(qiáng)，王 晶

卵巢癌的病死率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中排列第二。卵巢癌常用化療方案是鉑類(lèi)聯(lián)合紫杉醇，但是部分患者會(huì)出現(xiàn)紫杉醇過(guò)敏等化療副反應(yīng)，需要更換藥物，因此，尋找其他中藥有效成分具有重要臨床意義。莪術(shù)醇是衡量中藥莪術(shù)油藥效的重要指標(biāo)之一。莪術(shù)醇在卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、消化道等上皮性惡性腫瘤中表現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用。但是目前關(guān)于莪術(shù)醇抗卵巢癌的作用機(jī)制研究尚少，并且未見(jiàn)其與鉑類(lèi)藥物聯(lián)合治療卵巢癌的報(bào)道。莪術(shù)醇不溶于水的理化性質(zhì)限制了該藥物在臨床上的使用，基于前期研究結(jié)論，納米制劑脂質(zhì)體莪術(shù)醇(liposome curcumol,LC)具有良好的抗卵巢漿液性癌的作用，該研究使用 LC聯(lián)合順鉑，研究聯(lián)合用藥抗卵巢癌的作用和機(jī)制，為該疾病的臨床治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV購(gòu)自于賽百慷公司，HO8910由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院贈(zèng)送。LC由合肥工業(yè)大學(xué)合成；順鉑(江蘇諾欣)； p-AKT (CST,#4060)、AKT (CST,#4691)、cleaved-Caspase3(CST,#9664)、cleaved-Caspase8 (WL0153)、cleaved-Caspase9(WL03421)。

1.2 方法

1.2.1

人卵巢癌細(xì)胞株的培養(yǎng) HO8910使用DMEM培養(yǎng)基，SKOV使用McCoy′s 5A Medium培養(yǎng)基，培養(yǎng)基均含有1%雙抗和10%胎牛血清，培養(yǎng)在37 ℃，5% CO的培養(yǎng)箱中，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，用胰酶進(jìn)行消化傳代。

1.2.2

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照每孔1×10個(gè)/孔的密度接種至96孔板中培養(yǎng)，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組：空白脂質(zhì)體組[0(對(duì)照組)、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/ml]，順鉑組[0(對(duì)照組)、2、4、8、16、32、64 μg/ml]，LC組[0(對(duì)照組)、5、10、20、40、80 μg/ml]，不同濃度順鉑+10 μg/ml LC的聯(lián)合組[順鉑濃度：0(對(duì)照組)、2、4、8、16、32、64 μg/ml]，各組細(xì)胞和藥物共培養(yǎng)24 h后進(jìn)行檢測(cè)，每孔加入10 μl的MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，吸盡各孔溶液，加入150 μl的DMSO，室溫孵育15 min，最后使用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定各孔吸光度(optical density，OD)值。細(xì)胞存活率=(OD/OD)×100%。根據(jù)各組中各孔OD平均值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.3

實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組(含有12.5 μg/ml裸脂質(zhì)體的培養(yǎng)基)，LC組(10 μg/ml)，順鉑組(8 μg/ml)，聯(lián)合組(8 μg/ml的順鉑+10 μg/ml的LC)，各組與藥物共培養(yǎng)24 h后回收細(xì)胞。

1.2.4

Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 在預(yù)冷條件下給小室鋪膠，然后按照3×10個(gè)細(xì)胞/ml的密度將各組100 μl細(xì)胞懸液加入小室中，小室下層加入500 μl含有12% FBS的培養(yǎng)基，孵育一定時(shí)間后，結(jié)晶紫染色顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。檢測(cè)細(xì)胞遷移能力時(shí)，小室中不需要基質(zhì)膠包被基底膜，其他步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.5

流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞制成每管有1×10個(gè)細(xì)胞的樣品備檢測(cè)，通過(guò)Annexin-V FITC和PI雙染后，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，并使用CytExpert軟件進(jìn)行分析。

1.2.6

Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞提取蛋白，10% SDS-PAGE凝膠電泳，200 mA、100 min轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入GAPDH(1 ∶2 000),AKT (1 ∶1 000),p-AKT(1 ∶2 000),cleaved-Caspase8(1 ∶500),cleaved-Caspase9(1 ∶500),cleaved-Caspase3(1 ∶1 000)的一抗4 ℃搖床過(guò)夜，加入二抗，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

2.1 順鉑聯(lián)合LC對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響

如圖1A～C所示，對(duì)于SKOV和HO8910，聯(lián)合用藥能顯著抑制兩種卵巢癌細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

SKOV=84.98,

P

<0.05;

F

=177.30,

P

<0.05)，并且藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制呈濃度梯度依賴性。計(jì)算各組IC，對(duì)于SKOV細(xì)胞，聯(lián)合用藥時(shí)順鉑的IC為(12.67±2.03) μg/ml，單用順鉑時(shí)的IC為(38.28±5.98) μg/ml;對(duì)于HO8910細(xì)胞，聯(lián)合用藥時(shí)順鉑的IC為(10.55±1.55) μg/ml，單用順鉑時(shí)的IC為(26.41±2.30) μg/ml。圖1D提示不同濃度的裸脂質(zhì)體對(duì)兩種細(xì)胞增殖抑制不明顯。

圖1 LC聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響A:LC(10 μg/ml)聯(lián)合不同濃度順鉑(0、2、4、8、16、32、64 μg/ml)對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響；B:LC(10 μg/ml)聯(lián)合不同濃度順鉑(0、2、4、8、16、32、64 μg/ml)對(duì)HO8910 細(xì)胞增殖能力的影響；C:不同濃度LC(5、10、20、40、80 μg/ml)對(duì)兩種細(xì)胞增殖能力的影響；D:不同濃度裸脂質(zhì)體(0、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/ml)對(duì)SKOV3和HO8910細(xì)胞增殖的影響；與順鉑組比較：*P<0.05；與對(duì)照組比較：#P<0.05

2.2 聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

聯(lián)合用藥可以降低SKOV和HO8910細(xì)胞的遷移能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

SKOV=274.40,

P

<0.05;

F

=125.35,

P

<0.05)；聯(lián)合用藥可以降低SKOV和HO8910細(xì)胞的侵襲能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

SKOV=87.52,

P

<0.05;

F

=148.15,

P

<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 聯(lián)合用藥(8 μg/ml的順鉑+10 μg/ml的LC)對(duì)SKOV3和HO8910細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響A:Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量圖 結(jié)晶紫染色 × 100；B:遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；C:侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與順鉑組比較：#P<0.05

2.3 聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響

聯(lián)合用藥組SKOV和HO8910細(xì)胞的凋亡率高于單用順鉑組，分別為SKOV：(50.87±4.59)%

vs

(21.05±1.21)%，HO8910：(59.05±1.15)%

vs

(30.77±3.50)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

SKOV=226.77,

P

<0.05;

F

=337.68,

P

<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3和HO8910凋亡的影響A:Annexin-V FITC/PI雙染法實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；B:SKOV3細(xì)胞株聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；C:HO8910細(xì)胞株聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；與順鉑組比較：*P<0.05；與對(duì)照組比較：#P<0.05

2.4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

SKOV和HO8910細(xì)胞內(nèi)p-AKT的蛋白水平在順鉑組和聯(lián)合組出現(xiàn)下降，并且聯(lián)合組的表達(dá)量低于單用順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

SKOV=1 695.62,

P

<0.05;

F

=245.31,

P

<0.05)。凋亡相關(guān)蛋白cleaved-Caspase8、9、3的表達(dá)量在順鉑組和聯(lián)合組呈增高趨勢(shì)，并且聯(lián)合組的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (

F

cas8-SKOV=270.32,

P

<0.05;

F

cas9-SKOV=118.37,

P

<0.05;

F

cas3-SKOV=288.34,

P

<0.05;

F

=348.36,

P

<0.05;

F

=105.01,

P

<0.05;

F

=89.57,

P

<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)SKOV3和 HO8910細(xì)胞的AKT、p-AKT、cleaved-Caspase8、9、3蛋白水平1：AKT；2：p-AKT；3：cleaved-Caspase8；4：cleaved-Caspase9；5：cleaved-Caspase3;與順鉑組比較：*P<0.05；與對(duì)照組比較：#P<0.05

3 討論

據(jù)報(bào)道，2019年美國(guó)新發(fā)卵巢癌21 750例，死亡13 940例，卵巢癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤的2.5%，致死率占總數(shù)的5%，在中國(guó)45～50歲女性中卵巢癌致死率位居惡性腫瘤第5位，因此，卵巢癌是一種致死率較高的女性惡性腫瘤。卵巢癌一線治療方案為鉑類(lèi)聯(lián)合紫杉醇，但是患者如果出現(xiàn)鉑類(lèi)耐藥或者對(duì)紫杉醇過(guò)敏，可供選擇的二線藥物種類(lèi)較少，因此，尋找新的卵巢癌治療藥物是研究熱點(diǎn)。中醫(yī)中藥在治療婦科腫瘤方面歷史悠久，臨床上早已有使用莪術(shù)抗婦科腫瘤的臨床經(jīng)驗(yàn)，中醫(yī)理論認(rèn)為,莪術(shù)味辛、苦、溫,歸肝、脾經(jīng),具有行氣破血、消積止痛的功效，它的提取物莪術(shù)油作為抗腫瘤藥物在1977年被中國(guó)藥典收藏，莪術(shù)醇是莪術(shù)油的重要活性成分。研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)醇可以抗卵巢癌，它能通過(guò)PI3K/AKT和JAK2/STAT3通路，抑制卵巢癌細(xì)胞株SKOV的增殖、侵襲能力，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。前期研究已經(jīng)合成了穩(wěn)定的LC，并發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體運(yùn)載莪術(shù)醇可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)PERK-ATF4-CHOP途徑促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，尤其對(duì)原代卵巢高級(jí)別漿液性腺癌細(xì)胞有較好的抗腫瘤作用，同時(shí)莪術(shù)醇對(duì)正常卵巢細(xì)胞呈低毒性。莪術(shù)醇不僅具有抗腫瘤作用，還能作為一線化療藥物的增敏劑。有研究報(bào)道稱莪術(shù)醇可以增加肺癌細(xì)胞對(duì)塞來(lái)西布化療的敏感性，可以通過(guò)PI3K/AKT途徑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇可以增強(qiáng)順鉑抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，不同的細(xì)胞株對(duì)聯(lián)合用藥的反應(yīng)不一樣，HO8910細(xì)胞株對(duì)聯(lián)合用藥較為敏感，而SKOV細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性稍差，但是順鉑和莪術(shù)醇聯(lián)合使用能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。兩藥聯(lián)合使用時(shí)順鉑和莪術(shù)醇藥物濃度均較低，因此可以降低藥物的不良反應(yīng)，減少藥物的毒副作用。

PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞存活、增殖、遷移以及蛋白質(zhì)合成方面發(fā)揮重要作用，AKT的Thr308位點(diǎn)可以被PDK1磷酸化而被活化，活化后的AKT可以結(jié)合下游受體調(diào)控細(xì)胞周期，加速細(xì)胞周期從G1期到S期的轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。另外也可以通過(guò)影響核轉(zhuǎn)錄因子和基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)途徑促進(jìn)細(xì)胞的侵襲，還可以通過(guò)磷酸化Caspase9或調(diào)控Bcl-2家族的蛋白活性，調(diào)控Caspase-9的活性，從而調(diào)控凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，有研究發(fā)現(xiàn)p-AKT的表達(dá)與卵巢癌的分化程度，臨床分期，化療藥物耐藥以及生存期相關(guān)，抑制AKT的磷酸化是治療卵巢上皮性惡性腫瘤的重要靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，順鉑和LC的聯(lián)合使用可以抑制AKT的磷酸化水平，對(duì)AKT蛋白水平?jīng)]有影響，并且促進(jìn)凋亡啟動(dòng)蛋白Caspase8,9和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase3的表達(dá)，因此推測(cè)順鉑與LC的聯(lián)合用藥可能通過(guò)抑制AKT的磷酸化來(lái)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，但是聯(lián)合用藥如何抑制AKT磷酸化的分子機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。