ETV4在結腸癌中的表達及其對結腸癌侵襲能力的影響

郜慶祖，陳亦揚，狄文玉，于 建，李勁松，尚 杰，張景航，趙衛星，蘇 蔚

結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年發病人數占所有惡性腫瘤的10%，其發病率在男性和女性惡性腫瘤中分別位列第三位和第二位。結腸癌患者5年生存率約為60%，生存時間在很大程度上取決于組織學分期，Ⅰ、Ⅱ期的生存率高于Ⅲ、Ⅳ期，伴有淋巴結或遠處轉移的患者生存率則急劇下降。為更好地控制結腸癌，延長患者的生存時間，有必要進一步探索結腸癌轉移的分子機制。該研究通過在線生物信息學網GEPIA分析了TCGA數據庫中結腸癌與正常結腸組織中差異表達的基因，從中篩選出在癌中表達升高的基因——E26轉錄因子變異體4(E26 transformation-specific variant 4，ETV4)，并通過生物信息學網R2分析了GEO數據庫中結腸癌和正常組織中ETV4的表達情況和其相關基因。

ETV4是多瘤病毒增強子激活劑3(polyomavirus enhancer activator 3，PEA3)亞家族成員，在生理和病理過程中都起著重要作用。有研究發現，ETV4與肺癌不良預后有關。在卵巢癌細胞中PEA3過表達能夠促進癌細胞的侵襲能力。然而，ETV4在結腸癌中的生物學作用尚不完全清楚。該研究旨在通過觀察ETV4在結腸癌組織及細胞系中的表達情況及其生物學功能，探究其影響結腸癌轉移的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

結腸癌組織標本 收集2015年1月—2018年12月新鄉醫學院第一附屬醫院病理科存檔的結腸腺癌石蠟包埋的標本，包括原發癌標本(

n

=62)和配對的癌旁組織(距離腫瘤邊緣5 cm以內的正常組織)，所有患者術前均未接受過放療或化療。病理診斷均由2位副高級以上病理醫師獨立閱片確診。病理分期采用TNM分期。該研究獲得新鄉醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準。

1.1.2

主要試劑與儀器 TRIzol和去基因組逆轉錄試劑盒(日本TAKARA公司)；RPMI1640培養基和胎牛血清(美國Gibco公司)；Transwell小室(孔徑8 μm)和基質膠(美國Corning公司)；免疫組化相關試劑及試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；Lipofectamine 3000試劑(美國Invitrogen公司)；ETV4一抗(美國Abcam公司)；MMP7一抗(美國Proteintech公司)；細胞裂解液、蛋白定量試劑盒、α-Tubulin一抗和過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(江蘇碧云天生物所)；靶向ETV4小干擾RNA(si-ETV4)、靶向MMP7小干擾RNA(si-MMP7)、陰性對照siRNA(si-NC)和ETV4過表達(ETV4-OE)(上海吉瑪公司)。BX53顯微鏡(日本Olympus 公司)；RTQ-960 Pro實時熒光定時PCR系統(杭州艾康生物技術有限公司)；蛋白電泳電轉系統(美國Bio-Rad公司)；Azure3000成像儀(美國Azure公司)。

1.1.3

細胞 人結腸癌細胞系(HCT116、LS174T、SW480、LOVO、SW620和RKO細胞)以及人永生化結腸上皮細胞(FHC)購自美國ATCC細胞庫，所有細胞使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，在37 ℃、含5% CO的溫濕培養箱中培養。以上所有細胞系均已通過專業STR分析鑒定，支原體污染陰性。

1.2 方法

1.2.1

生物信息學分析 通過生物信息網GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析了結腸腺癌(275例)和正常結腸組織(349例)中的差異表達基因。利用生物信息網R2(http://r2.amc.nl)在線預測了ETV4在結腸癌患者和正常結腸組織中的表達及其相關基因。

1.2.2

免疫組織化學檢測ETV4在組織中的表達 采用免疫組化Envision二步法檢測石蠟包埋直結腸癌組織及癌旁組織中ETV4蛋白表達。ETV4陽性定位于細胞核，表達強度采用半定量法，根據染色的強度和陽性細胞所占的比例進行評分：A：根據染色強度分為0分(不著色)，1分(淺黃色)，2分(黃色)，3分(棕黃色)；B：根據陽性細胞比例分為1分(陽性細胞<1/3)，2分(陽性細胞占1/3～2/3)，3分(陽性細胞>2/3)。兩種評分的乘積包括0、1、2、3、4、6和9，將乘積≤3定義為低表達，乘積≥4定義為高表達。

1.2.3

細胞轉染 按照實驗設計和轉染試劑說明書步驟，用Lipofectamine 3000試劑分別將si-ETV4、si-MMP7、si-NC和ETV4-OE轉染入LOVO細胞。簡要過程為，取對數生長期LOVO細胞再次接種在6孔板中，待細胞匯合度達60%～80%時進行轉染；并在轉染前20 min換用無血清培養液；然后分別將Lipofectamine 3000和上述質粒混合均勻的混合物滴加入細胞，繼續用無血清培養液培養6 h后將培養液換成含10%胎牛血清的培養基繼續培養48 h。收集細胞，用于后續實驗。

1.2.4

RT-qPCR 使用TRIzol試劑從培養細胞中提取總RNA。使用去基因組逆轉錄試劑盒從1 μg RNA中合成互補DNA(cDNA)，實時定量PCR(q-PCR)使用TB Green試劑進行，GAPDH作為內參。反應條件為94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s，循環數40。使用2方法計算目的基因的相對表達量。每個樣本設3個復孔。引物序列ETV4：F：5′-GCTCGCTGAAGCTCAGGT-3′；R:5′-TCCTTCTTGATC CTGGTGGT-3′。

1.2.5

Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲 預先用基質膠包被Transwell小室的底膜并放入24孔Transwell專用板中。將轉染后的細胞分散在300 μl無血清的培養基中并加入小室內；向小室下部的孔中加入700 μl含20% FBS的培養基。孵育48 h后，將穿出到膜下表面的細胞用甲醇固定，Giemsa染色，并在顯微鏡下拍照，在光學顯微鏡下以×400放大倍數計數細胞。實驗至少重復3次。

1.2.6

Western blot實驗 用細胞裂解液提取上述收集的細胞的蛋白，蛋白經定量后，取等量蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將電泳分離蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h。分別在ETV4(1 ∶1 000稀釋)、MMP7(1 ∶2 000稀釋)或α-Tubulin(1 ∶10 000稀釋)一抗反應液中4 ℃孵育過夜。洗膜后，將膜在1 ∶1 000稀釋的過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗反應液孵育1 h。再次洗膜后，通過ECL化學發光顯像，使用Azure 3000成像儀進行掃描目的條帶光密度值。

2 結果

2.1 ETV4在結腸癌組織及細胞系中表達顯著升高

通過生物信息網GEPIA比較了結腸腺癌(

n

=275)與正常組織(

n

=349)中的差異基因，發現在結腸腺癌中表達升高的前10位基因中，ETV4處于第7位。利用生物信息學網R2在線比較了GEO數據庫中正常結腸基因芯片數據(GSE8671，

n

=33)和結腸癌基因芯片數據(GSE4554，

n

=84)中ETV4的表達，發現與正常組織比較，ETV4在結腸癌中表達升高(

t

=15.296，

P

<0.001，圖1A)。采用免疫組化檢測了62例結腸癌組織和配對癌旁黏膜組織中ETV4蛋白表達，結果(圖1B)顯示，ETV4在結腸癌組織中呈強陽性，而在正常黏膜中呈陰性或弱陽性；將ETV4表達強度分為高表達和低表達組，并與臨床病理參數進行關聯性分析發現，ETV4的表達強度和結腸癌的組織分級以及T、N、M分期呈正相關，而與患者年齡、性別以及腫瘤部位無關(表1)。RT-qPCR結果顯示，與人永生化結腸上皮細胞FHC比較，結腸癌細胞系HCT116、LS174T、SW480、LOVO、SW620和RKO中ETV4的mRNA水平均升高(

F

=89.736，

P

<0.001，圖1C)。

圖1 ETV4在結腸腺癌中表達升高A：利用R2獲取GEO數據中ETV4在結腸癌與正常組織中的表達；B：免疫組化染色顯示ETV4在結腸癌與正常組織中的表達，比例尺：50 μm；C：RT-qPCR結果顯示結腸癌細胞中ETV4 mRNA表達情況；與PHC細胞比較：***P<0.001

表1 ETV4表達與臨床病理參數的關系(n)

2.2 ETV4促進結腸癌的侵襲能力

實驗通過轉染過表達質粒和小干擾RNA對ETV4進行過表達和沉默，RT-qPCR檢測發現，與對照組(1.00±0.15)比較，ETV4過表達組(轉染ETV4-OE質粒)ETV4 mRNA表達水平(51.18±5.26)升高(圖2A，

t

=17.228，

P

<0.001)；與si-NC組(1.03±0.12)比較，ETV4沉默組(轉染si-ETV4)ETV4 mRNA表達水平(0.18±0.03)降低(圖2B，

t

=13.502，

P

<0.001)。Transwell侵襲實驗結果顯示，ETV4過表達組穿出小室的細胞數量(118.25±6.78)相對于對照組(56.72±4.52)增多(圖2 C、D；

t

=7.173，

P

<0.001)；ETV4沉默組穿出小室細胞數量(39.26±4.29)較對照組(61.45±7.34)減少(圖2E、F，

t

=6.385，

P

=0.005)。

圖2 ETV4對LOVO細胞侵襲能力的影響A、B：RT-qPCR驗證在LOVO中過表達和沉默ETV4效果，與對照組比較：***P<0.001,與si-NC組比較：###P<0.001；C：Transwell實驗觀察過表達ETV4對LOVO細胞侵襲能力的影響，比例尺：50 μm；D：對圖C的定量圖，與對照組比較：**P<0.01；E：Transwell觀察敲除ETV4對LOVO細胞侵襲能力的影響，比例尺：50 μm；F：對E的定量圖,與si-NC組比較：##P<0.01

2.3 MMP7是ETV4的下游基因

R2生物信息網在線分析了TCGA數據庫中286例結腸癌的基因表達數據的結果顯示，在mRNA水平，MMP7和ETV4表達呈正相關(

R

=0.527，

P

<0.001，圖3A)。Western blot結果(圖3B)顯示，與si-NC組(1.00±0.06)比較，ETV4沉默組MMP7蛋白相對表達量(0.58±0.78)減少(

t

=5.538，

P

=0.012)；與對照組(1.00±0.13)比較，ETV4過表達組MMP7蛋白相對表達量(2.25±0.43)增多(

t

=8.215，

P

<0.001)。

圖3 MMP7是ETV4的下游基因A：TCGA結腸癌基因表達數據分析ETV4和MMP7表達相關性； B：Western blot檢測ETV4對MMP7蛋白表達的影響

2.4 ETV4通過MMP7促進結腸癌的侵襲能力

為驗證ETV4是否通過MMP7促進LOVO細胞的侵襲能力，本研究采用了功能恢復實驗。Western blot實驗結果(圖4A、B)顯示，與ETV4過表達組比較，ETV4過表達聯合MMP7沉默組ETV4蛋白表達無明顯改變，而MMP7蛋白表達明顯下降(

F

=84.192，

P

<0.001)；Transwell侵襲實驗結果(圖4C、D)顯示，與對照組(52.33±4.28)比較，ETV4過表達組穿出膜的細胞數量(121.67±18.61)增多(

F

=24.326，

P

=0.005)；過表達ETV4 聯合MMP7沉默組穿出小室的細胞數量(58.06±6.37)較ETV4過表達組減少(

P

=0.006)。本部分實驗結果說明，ETV4至少部分通過MMP7促進結腸癌細胞的侵襲能力。

圖4 ETV4通過 MMP7促進結腸癌LOVO細胞的侵襲能力A：Western blot顯示不同處理細胞中ETV4和MMP7蛋白表達；B ：對A圖的定量；C:Transwell檢測不同處理組細胞的侵襲能力實驗結果統計圖；D:Transwell檢測不同處理組細胞的侵襲能力示意圖(標尺50 μm)；1：對照組；2：ETV4過表達組；3：ETV4過表達聯合MMP7沉默組；與對照組比較：**P<0.01，***P<0.001；與ETV4過表達組比較：##P<0.01

3 討論

人類ETS家族有28個成員，根據其相對序列分為4個不同的類別，或者根據其結構的相似程度分為12個亞家族。同源的ETV1、ETV4和ETV5蛋白形成PEA3亞家族，但它們在某些組織中的表達模式可能完全不同，這表明這些PEA3家族成員具有不同的調控方式。在尤文肉瘤中，ETV1或ETV4的染色體易位是腫瘤發生的根本原因；同樣，在大多數前列腺癌中觀察到ERG和ETV1/4/5亞家族的染色體重排。據報道，在胃癌患者中，ETV4 mRNA高表達者占64%，而ETV1和ETV5 mRNA高表達僅分別占31%和26%。ETV4在食管鱗狀細胞癌中明顯升高，并且過表達預示著較短的生存時間。然而，ETV4在結腸癌中的表達和功能尚不清楚。本研究通過生物信息網GEPIA分析發現ETV4在結腸癌中表達升高，并通過免疫組化證實了這一結果，同時發現結腸癌中ETV4高表達可能預示著高的組織學和TNM分期，說明ETV4在結腸癌進展中可能起重要作用。

功能研究發現，ETV4能夠促進結腸癌的侵襲能力。為探索ETV4在腫瘤細胞中的分子機制，本研究使用生物信息網R2預測了ETV4表達相關基因，發現MMP7與ETV4表達呈正相關。MMP7是基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族中的一員。MMPs能夠降解基底膜，促進腫瘤微血管生成，從而有利于惡性腫瘤侵襲和轉移。有文獻報道，結腸癌患者血清中MMP7過表達，并與預后不良有關。本研究結果顯示，ETV4能夠促進結腸癌細胞MMP7表達從而促進細胞侵襲能力，沉默MMP7消除了ETV4過表達對結腸癌細胞侵襲的促進作用，由此推測，MMP7可能是ETV4下游功能基因并介導了ETV4對結腸癌的侵襲促進功能。

綜上所述，ETV4在結腸癌中高表達，并促進結腸癌細胞的侵襲能力，進一步發現MMP7是ETV4的下游功能基因。本研究拓展了對結腸癌轉移機制的認識，為預防和治療結腸癌提供了重要的理論依據。