染料木黃酮增強阿比特龍抑制去勢抵抗前列腺癌細胞22RV1效應研究

伏天雨，周圓媛，陳 恬，馮海嬌，彭 湃，朱彥鋒

前列腺癌是全球男性人群最常見的泌尿生殖系統的惡性腫瘤。2018年全球癌癥統計報告顯示全球新發病例排名第4位的是前列腺癌，男性病例中前列腺癌排名第2位。我國男性前列腺癌發病率居第6位，病死率居第7位。2018年全球新增前列腺癌患者127.6萬例，死亡35.9萬例。前列腺癌的生長與雄激素睪酮升高有關，去除睪酮是針對晚期前列腺癌的治療方法。但經過2～3年后，腫瘤不再受雄激素的控制，會繼續增長。經過初次持續雄激素剝奪治療后疾病依然進展的前列腺癌，把這個階段稱之為去勢抵抗前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)。染料木黃酮(genistein，GEN)是大豆異黃酮中的一種生物學功能成分。研究證明大豆異黃酮可防治與激素有關的癌癥，其具有抗前列腺癌的活性，主要表現在抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成和侵襲以及與抗癌藥物的協同，對前列腺癌細胞產生拮抗作用。阿比特龍(abiraterone,ABT)可抑制細胞色素P450c17(CYP17A1)，從而降低CRPC患者的雄激素水平、前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen,PSA)水平，發揮抗腫瘤作用。目前通過體外實驗利用GEN增強ABT抗CRPC作用效果的相關研究甚少。該研究旨在探討GEN可在體外增強ABT對CRPC細胞的抑制作用，并初步探討其作用機制。該研究探索了植物化學物質輔助治療CRPC的新方法，從膳食聯合用藥的角度為防治腫瘤提供了新思路，具有較大的生物醫學意義。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

CRPC細胞株22RV1(中國科學院上海細胞庫)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天)，ELISA試劑盒(中國Elabscience)，GEN和DMSO(美國Sigma)，ABT(中國MCE)，無酚紅RPMI-1640 培養液和無酚紅DMEM高糖培養液(以色列Biological Industries)，胎牛血清(美國Gibco)，蛋白酶抑制劑混合物(中國凱基)，Western blot及IP細胞裂解液(中國碧云天)，Western blot化學發光HRP底物(美國Millipore)，Anti-PSA(美國Santa Cruz)，增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，AKR1C3單抗，Anti-CYP17A1及Anti-Ki67(美國Abcam)，Anti-β-actin和Anti-GAPDH(中國中杉金橋)。

1.2 細胞培養

將22RV1用含10%胎牛血清的培養基，置細胞培養箱培養，培養環境為37 ℃、5% CO，傳代至所需細胞量備用，選對數生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞增殖實驗

將對數期細胞用胰酶消化，制成細胞懸液。稀釋至5×10個/ml細胞，細胞按5 000個/孔的密度接種于96孔板。37 ℃、5% CO及飽和濕度條件下種板24 h。加入終濃度為0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L的ABT在對應孔，設5個復孔，培養24、48、72 h。配置終濃度為0.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L的GEN，加入對應孔，培養48 h。用40 μmol/L ABT與不同劑量的GEN混合，同樣配制培養基，終濃度分別為0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，加入對應孔，培育24 h。最終每孔加入100 μl MTT孵育4 h，再加入150 μl DMSO，用酶標儀檢測490 nm處的吸光度。細胞活力=[(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

1.4 免疫細胞化學實驗

將22RV1細胞接種于6孔板，每孔20 000個。在37 ℃、5% CO及飽和濕度條件下培養24 h。加入100 μl GEN與ABT的混合培養液，終濃度分別為0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，并于37 ℃、5% CO培養箱培養48 h，體積分數4%多聚甲醛固定，0.5% Triton-100 通透，5% BSA 常溫下封閉1 h。孵育抗體兔抗人Ki-67單克隆抗體，并于4 ℃孵箱過夜。在常溫下避光孵育1 h二抗山羊抗兔 IgG，用 DAPI 復染，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 Western blot檢測蛋白的表達

配制40 μmol/L ABT與不同劑量的GEN的混合培養基，終濃度分別為0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，在37 ℃培養箱中培養22RV1細胞48 h，加入預冷的PBS將處理液沖洗3次直至干凈。在冰上用裂解液裂解20 min，收集細胞裂解液，7 200 r/min 離心15 min，用BCA法對上清液進行蛋白定量并分裝保存于-70 ℃待用。制備 SDS-PAGE凝膠，利用80 V(濃縮膠)/120 V(分離膠)電壓對蛋白質進行分離，100 V電壓轉膜90 min。PVDF膜用TBST沖洗，用5%脫脂牛奶封閉，室溫震搖1～2 h。TBST洗膜3次，每次5 min，加入一抗(1 ∶1 000)4 ℃過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗(1 ∶4 000)室溫孵育1.5 h。TBST洗膜3次，每次10 min。凝膠成像系統成像。

1.6 酶聯免疫吸附試驗

配制40 μmol/L ABT與不同劑量的GEN的混合培養基，終濃度分別為0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，在37 ℃培養箱中培養22RV1細胞48 h。加入預冷的PBS，處理液沖洗3次至干凈。用適量胰酶消化細胞，離心5 min，PBS沖洗3次后重懸。經過反復凍融，提取液再離心5 min，取上清液待用。最終按照試劑盒的具體操作步驟操作，測出標準品和待測樣品的吸光度值，并繪制標準曲線圖，并計算出樣品的濃度。

2 結果

2.1 ABT對22RV1細胞活力有抑制作用

使用MTT比色法檢測不同濃度的0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L ABT處理22RV1細胞24、48、72 h的細胞活性。結果顯示ABT對22RV1細胞增殖具有抑制作用，且劑量越高，抑制作用越強、作用時間越長，抑制作用越強，呈明顯的劑量、時間依賴關系(圖1)。

圖1 ABT對22RV1細胞增殖能力的影響A：ABT對22RV1處理24 h后增殖能力的影響；B：ABT對22RV1細胞處理48 h增殖能力的影響；C：ABT對22RV1細胞處理72 h增殖能力的影響；與Con組比較： *P<0.05

2.2 GEN可增強ABT對22RV1細胞的抑制作用

配制40 μmol/L ABT與不同劑量的GEN的混合培養基，終濃度分別為0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，在體外對22RV1細胞處理48 h。MTT結果顯示，GEN可在體外抑制CRPC細胞的活力，并可增強ABT對22RV1細胞的抑制作用(圖2)。

圖2 GEN聯合ABT對CRPC細胞活力的影響A：GEN對22RV1細胞活力的影響；B：GEN聯合ABT對22RV1細胞增殖能力的影響；1：control組；2：ABT 40 μmol/L；3：ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L；4：ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L；5：ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L；與control組比較：*P<0.05；與ABT組比較：#P<0.05

2.3 GEN可增強ABT對Ki-67的抑制作用

配制40 μmol/L ABT與不同劑量的GEN的混合培養基，終濃度分別為0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，處理22RV1細胞48 h。免疫細胞化學法結果顯示，GEN可增強ABT對Ki-67的抑制作用(圖3)。

圖3 GEN和ABT聯合作用對22RV1細胞Ki-67表達的影響 ×2001：control組；2：ABT 40 μmol/L；3：ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L；4：ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L

2.4 GEN和ABT未能在體外顯著降低22RV1細胞中的睪酮水平

配制40 μmol/L ABT與不同劑量的GEN的混合培養基，終濃度分別為0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，處理22RV1細胞24 h，ELISA法檢測22RV1細胞裂解液中的睪酮水平，發現睪酮水平未顯著下降，差異無統計學意義(圖4)。

圖4 GEN和ABT聯合作用對22RV1細胞睪酮合成的影響1：control組；2：ABT 40 μmol/L；3：ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L；4：ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L；5：ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L

2.5 GEN和ABT未能顯著降低CRPC細胞中CYP17A1的表達

研究中配制40 μmol/L ABT與不同劑量的GEN的混合培養基，終濃度為 0、ABT 40 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L、ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L，培養22RV1細胞 48 h。用Western blot法檢測細胞中PCNA、PSA、CYP17A1和AKR1C3的表達。實驗結果顯示，GEN和ABT聯合時未能降低細胞中CYP17A1的表達，但對PCNA、PSA和AKR1C3有抑制作用(圖5)。

圖5 GEN和ABT聯合或單獨處理對22RV1細胞PCNA、PSA、CYP17A1和AKR1C3表達的影響1：control組；2：ABT 40 μmol/L；3：ABT 40 μmol/L+GEN 12.5 μmol/L；4：ABT 40 μmol/L+GEN 25.0 μmol/L；5：ABT 40 μmol/L+GEN 50.0 μmol/L

3 討論

臨床研究證明GEN被認為是具有抗癌活性的天然藥物，是抗腫瘤藥物的先導植物型化合物之一。研究表明使用GEN可使22RV1細胞阻滯在G/M期，抑制Ki-67的表達，抑制CRPC細胞的增殖，最終達到抗前列腺癌的效果。GEN可能通過調控ER-akt、PSA、p21、Cyclin D1和CDK4的表達來抑制前列腺癌細胞的增殖，顯示抗前列腺癌效果。此外臨床上已有研究針對二期雙盲臨床試驗，證實了GEN對前列腺癌患者的安全性和有效性。臨床研究的初步結果肯定了GEN作為化學預防藥物的潛力，并鼓勵進一步的研究。

GEN和ABT都能通過抑制前列腺癌細胞的增殖，發揮抗腫瘤效應。有研究顯示，GEN可以在體外抑制雄激素細胞的增殖。Ki-67是一種反映腫瘤細胞增殖情況的核抗原。本研究采用免疫組化法檢測時，發現聯合用藥時，ABT的濃度一定時，隨著GEN的濃度增加，抗原Ki-67的表達減少，表明GEN可增強ABT的抗CRPC能力。PCNA是增殖細胞核抗原，在腫瘤細胞增殖上起關鍵作用，是反映腫瘤細胞增殖的良好指標。本研究中GEN可增強ABT降低PCNA的能力，說明GEN能夠增強ABT抗CRPC細胞增殖。血清PSA是前列腺癌的特異性標志物，是檢測和早期發現前列腺癌最重要的指標之一。與正常人比較，前列腺癌患者的PSA水平較高，測量PSA的水平有助于前列腺癌的篩選。本研究中免疫印跡實驗法檢測前列腺癌特異性抗原PSA的表達，發現聯合用藥時隨GEN劑量的增加，PSA的表達逐漸減弱，GEN可增強ABT的能力。ABT是CPY17酶抑制劑，與雄激素合成限速酶CYP17不可逆結合，抑制相關酶活性，進而阻斷雄激素的合成，抑制前列腺癌細胞的增殖。 CYP17A1是治療前列腺癌的重要靶點，可產生癌細胞生長所需的雄激素。ABT是CYP17A1抑制劑，它含有一種類似于內源性CYP17A1底物的甾體支架。在本研究中通過免疫印跡實驗法檢測CYP17A1的表達，未發現CYP17A1的表達減弱。原因可能是ABT是CYP17A1抑制劑，僅抑制CYP17A1的酶活性，使其失活導致不能進行后續反應，因而對CYP17A1的表達不會產生直接影響。AKR1C3是雄激素合成最后兩步的關鍵酶，在CRPC中高表達。本研究發現GEN和ABT作用于22RV1細胞后，抑制AKR1C3的表達。類似有研究證明異黃酮類化合物對去勢抵抗性前列腺癌靶標AKR1C3 具有較強的體外抑制活性作用。另有研究發現AKR1C3可以克服ABT耐藥性并提高晚期前列腺癌患者的生存率。

本研究發現，與單獨使用ABT比較，GEN和ABT聯合作用時更能降低PCNA、PSA、CYP17A1和AKR1C3及抗原Ki-67的表達，發揮更強的抑制作用，說明GEN能夠增強ABT對CRPC細胞的抑制作用。CRPC是前列腺癌發展的后期階段，使用內分泌治療是現有的主要治療方法，如采用GEN聯合相應藥物提升治療效果，則可為CRPC的臨床治療提供新的思路。