小鼠孕晚期暴露脂多糖對老年期海馬GSNOR含量及與認知功能損害相關性研究

張雨欣，莊戰強，韋琪瑤，陳貴海，曹 磊

年齡相關性認知功能減退(age-associated cognitive decline，AACD)是衰老的常見癥狀和老年期癡呆的重要危險因素。闡明AACD的確切發病機制對于理解正常衰老向老年期癡呆的轉化具有重要意義。S-亞硝基化即NO將蛋白質半胱氨酸殘基氧化修飾形成S-亞硝基硫醇(s-nitrosothiols,SNOs)，為機體提供NO生物活性。而線粒體蛋白的過度S-亞硝基化會直接影響線粒體動力學活性、下調有氧代謝的效率以及抑制線粒體自噬功能，破壞線粒體穩態。S-亞硝基谷胱甘肽還原酶(S-nitrosoglutathione reductase，GSNOR)是一種對S-亞硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione，GSNO)具有高度特異性的去硝基酶，可催化去硝基反應，控制GSNO和蛋白SNOs的細胞內水平，并保護機體免受亞硝化應激的傷害。研究表明，全腦GSNOR的表達會隨著年齡的增長而下降，其缺乏會因亞硝基化應激而損害線粒體功能。研究表明，妊娠動物的內分泌等系統較非妊娠同齡動物顯著不同，導致其對不良因素，尤其是感染的敏感性更高，妊娠晚期更甚，且孕晚期炎癥暴露可以加速母親衰老過程中的AACD。然而海馬GSNOR是否參與空間學習記憶損害的相關性尚不了解，更不知孕晚期炎癥暴露是否會惡化此過程。該研究旨在探討孕晚期炎癥暴露對老年母鼠海馬GSNOR水平的影響及其與空間學習記憶能力改變的相關性。

1 材料與方法

1.1 動物處理

CD-1小鼠，2月齡，雄鼠30只，雌鼠60只，購于南京大學模式動物研究院。標準實驗條件下飼養，保持明暗周期 12 h，適宜溫濕度，自由進食飲水。CD-1小鼠于晚9：00按1 ∶2(雄 ∶雌)合籠，首次查到陰栓者為受孕第0天(G0)。在G15，將孕鼠隨機分為LPS組和CON組，LPS組連續4 d每天腹腔注射LPS 50 μg/(kg·d)，CON組則同期腹腔注射等容量生理鹽水，分別在飼養至6月齡和18月齡時，每組(6-CON、6-LPS、18-CON和18-LPS)隨機抽取6只進行實驗。有外傷、殘疾或是疾病的小鼠不納入實驗。本實驗經安徽醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 Morris水迷宮實驗

將直徑10 cm，高24 cm的可移動的圓柱狀逃生平臺放入直徑150 cm，高30 cm的黑色圓形水池中，向水池中注入溫度適宜的自來水，控制水位高于平臺1 cm，運用Any-maze軟件對小鼠在水迷宮中的運動軌跡進行分析，檢測其空間學習記憶能力。在距水池50 cm處用白色布簾圍起以屏蔽外界因素對實驗的干擾，并在距池底平面1.5 m高的簾子上等距離黏貼3個不同形狀的黑色標志物，作為小鼠進行空間定位的線索。實驗過程分為學習(定位航行)期和記憶(空間探索)期。① 學習期：在連續7 d的定位航行中，逃生平臺低于水面1 cm并固定于靶象限的中心。僅在第1天實驗開始前，將小鼠放在平臺上停留30 s以適應，每天將小鼠面對水池的外沿隨機從任一象限投入水中，允許其最多游泳60 s尋找平臺。實驗小鼠每只每天進行4次訓練，每次相隔15 min。記錄每次找到平臺前的平均游泳距離，距離越短代表學習能力越強。② 記憶期：在學習期的第7天，完成4次訓練后將逃生平臺拿出，小鼠恢復體力后從平臺放置象限(靶象限)相對的象限再次入水，在水池中任意游泳60 s。60 s內靶象限的游泳距離占總游泳距離的百分比越大代表記憶能力越強。

1.3 Western blot 分析

在行為學任務完成2周后，將小鼠引頸脫臼處死，冰上取腦并迅速剝離海馬，于-80 ℃超低溫冰箱保存。使用蛋白質中性裂解緩沖液進行組織裂解,提取蛋白，使用雙軟骨酸測定試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白溶解到等濃度后，按照1 ∶4加入5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min。室溫冷卻后按每孔5～10 μl注入SDS-PAGE膠加樣孔內。電泳儀參數設置為80 V，30 min用于濃縮膠；再設為120 V，1 h用于分離膠。恒流轉膜，漂洗5 min，再加入5%脫脂奶粉作為Western封閉液，在室溫封閉2 h。加入兔多克隆anti-GSNOR一抗(1 ∶800，美國Proteintech公司)，4 ℃孵育過夜,孵育結束后使用PBST洗滌。加入辣根酶標記山羊抗兔IgG二抗(1 ∶5 000，北京Zs-Bio公司)，室溫孵育2 h，之后用PBST洗滌。用ECL試劑盒對免疫反應的靶蛋白條帶進行可視化，使用Image J軟件進行蛋白條帶的結果分析，計算GSNOR的相對表達量。

2 結果

2.1 Morris水迷宮

2.1.1

定位航行 使用重復測量數據方差分析比較學習期數據可得，游泳路程隨訓練天數的增加而逐漸減少(

F

=29.683，

P

<0.01)，且6-CON、6-LPS、18-CON和18-LPS組間的游泳路程差異有統計學意義(

F

=13.073，

P

<0.01)。兩兩比較分析顯示，18-CON組游泳路程長于6-CON組，差異有統計學意義(

F

=12.510，

P

<0.01；圖1A)；18-LPS組也長于18-CON組,差異有統計學意義(

F

=25.579，

P

<0.01；圖1B)。而6-LPS組和6-CON組小鼠游泳路程差異無統計學意義(

F

=0.040,

P

=0.845;圖1C)。

2.1.2

空間探索 整體分析可見6-CON、6-LPS、18-CON和18-LPS組間的游泳路程百分比差異有統計學意義(

F

=45.833，

P

<0.01)，組間比較顯示，18-CON組小鼠靶象限游泳路程百分比低于6-CON組，差異有統計學意義(

F

=52.616，

P

<0.01)；18-LPS組小鼠靶象限游泳路程百分比也低于18-CON組,差異有統計學意義(

F

=10.582，

P

<0.01)。而6-LPS組和6-CON組小鼠靶象限游泳路程百分比差異無統計學意義(

F

=1.242，

P

=0.291;圖1D)。

圖1 小鼠Morris水迷宮中的成績A、B、C:學習期平均游泳路程；D：記憶期靶象限內的路程百分比；與6-CON組比較：**P<0.01；與18-CON組比較：##P<0.01

2.2 海馬GSNOR水平

6-CON、6-LPS、18-CON和18-LPS四組間的海馬GNSOR表達水平差異有統計學意義(

F

=201.862，

P

<0.01)，組間比較顯示，18-CON組小鼠海馬GSNOR(

F

=107.011，

P

<0.01)水平低于6-CON小鼠，6月齡(

F

=59.449，

P

<0.01)和18月齡(

F

=185.086，

P

<0.01)LPS組小鼠海馬GSNOR水平也低于同月齡CON組，差異均有統計學意義，見圖2。

圖2 Western Blot檢測小鼠海馬GSNOR的表達與6-CON組比較：**P<0.01；與18-CON組比較：##P<0.01

2.3 空間學習記憶能力與海馬GSNOR水平的相關性

Pearson分析表明，18-CON組和18-LPS組小鼠海馬GSNOR水平與游泳路程呈負相關(

r

=-0.836，

P

=0.038;

r

=-0.825，

P

=0.043)，與靶象限游泳路程百分比呈正相關(

r

=0.856，

P

=0.030;

r

=0.901，

P

=0.014)；而6-CON組和6-LPS組小鼠海馬GSNOR水平與平均游泳路程和靶象限游泳路程均無相關性(

P

>0.05)，見表1。

表1 GSNOR與Morris水迷宮成績的相關性[r (P值)]

3 討論

在人和嚙齒動物的正常衰老過程中，認知功能如空間記憶、工作記憶和長期記憶等逐漸下降。海馬在正常學習記憶鞏固中發揮重要作用，但非常脆弱，比其他腦區更早發生衰老引起的結構和功能變化。本課題組前期研究表明海馬相關的空間學習記憶功能會隨衰老進展而受損，且孕晚期暴露LPS會加速這種損害。LPS是一種常用于模擬實驗動物的細菌感染的強效內毒素，可提供持續的炎癥刺激。由LPS介導的全身性炎癥會引發神經炎癥，進而影響認知功能。懷孕的動物對LPS的敏感性增加，LPS引發母體免疫激活，導致母親和胎兒關鍵腦區基因表達異常。本研究中，18-CON組比6-CON組平均游泳路程延長(

P

<0.01)，靶象限游泳路程百分比降低(

P

<0.01)；18-LPS組比18-CON組的游泳路程延長(

P

<0.01)，靶象限游泳路程百分比降低(

P

<0.01)。這些結果與既往研究一致，即小鼠的空間學習記憶功能在衰老時受損，而孕晚期LPS暴露加重了這種損害。線粒體自由基衰老理論認為衰老是線粒體損傷累積的結果，線粒體功能障礙是多種年齡相關性疾病病理生理學的重要過程。許多參與氧化呼吸反應、線粒體動力學和線粒體自噬的線粒體蛋白質活性受到S-亞硝基化反應調節，過度S-亞硝基化會破壞線粒體正常的結構和功能，從而促進神經退行性疾病的發展。GSNOR作為重要的去硝基酶催化S-亞硝基化的線粒體蛋白的還原反應，與硝基酶共同調控細胞內蛋白S-亞硝基化水平。在嚙齒動物和人類衰老過程積累的初級衰老細胞中，發現GSNOR的表達減少。GSNOR缺陷(GSNOR)的小鼠腦中蛋白質S-亞硝基化的程度大大增加，并表現出加速衰老的一些特征，如肌肉質量減少和神經肌肉功能障礙，且大腦皮質α突觸核陽性蛋白出現積累。所以，GSNOR下調可能是衰老的重要指標。本研究中，18-CON組比6-CON組小鼠海馬GSNOR水平下降(

P

<0.01)，表明衰老可降低小鼠海馬GSNOR表達；6月齡和18月齡LPS組比同年齡CON組小鼠海馬GSNOR表達水平降低(

P

<0.01)，這表明孕期暴露LPS可能下調小鼠海馬GSNOR蛋白表達，尤其是老年小鼠。然而6月齡時LPS組并未表現出MWM成績差異，這提示GSNOR水平的降低可能是認知功能損害的前驅癥狀。進一步分析可得，海馬GSNOR水平與空間學習記憶能力的相關性僅見于18月齡小鼠，且6-LPS組GSNOR含量相較于6-CON組只下降了30%，而18-LPS組GSNOR含量在18-CON組較6-CON組下降40%的基礎上再降低了70%。因此我們推測海馬GSNOR水平與年齡相關性空間學習記憶減退有關，而青年期小鼠由于線粒體功能損傷輕微或腦內其余機制的代償尚未引起認知改變。在老年期(18月齡)，海馬線粒體損傷積累超過代償能力，表現出空間學習記憶能力的下降。

綜上所述,孕期暴露LPS加速老年母鼠空間學習記憶能力損害的作用至少涉及海馬線粒體GSNOR表達的嚴重降低。本課題組選定妊娠晚期這一特殊時期，研究炎癥刺激對于AACD的影響，而未將妊娠期作一因素變化，后期課題組將增加同齡非孕小鼠炎癥刺激對照組，進一步證實妊娠對于學習記憶的影響。將來的研究應進一步探索基因表達水平和GSNOR的降解因素如SUMO化、泛素化改變等。