細胞衰老誘導的抑制性細胞因子累積對DLBCL細胞功能的影響

易瀏穎，王極宇，陶千山，完顏智翔，朱鳳鳳，王會平，王芝濤，翟志敏

彌漫大B 細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是成人淋巴瘤最常見的一種類型，是一組在臨床表現和預后等方面具有高度異質性的淋巴造血系統惡性腫瘤。目前，應用以利妥昔單抗為基礎的免疫化療方案(R-CHOP)完全緩解率可達75%～80%。但是，仍有超過半數的患者接受R-CHOP方案治療后復發。

細胞衰老是一種穩定的細胞周期停滯狀態，機體在應對嚴重的細胞損傷時啟動基因重編程誘導受損細胞進入衰老狀態，使其分裂停止，防止潛在的有害細胞進一步增殖。細胞衰老過去一直被認為是機體防御腫瘤細胞無限增殖的重要屏障，近些年的研究卻顯示，腫瘤細胞衰老與腫瘤進展密切相關。該研究旨在探討細胞衰老在DLBCL細胞抵抗化療中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人DLBCL細胞株(LY8)購自上海細胞所；RPMI-1640培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；人外周血淋巴細胞分離液購自天津灝洋華科生物科技公司；細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自上海碧云天公司；ELISA試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；鹽酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX)購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1

病例資料 選擇2018年9月—2020年7月在安徽醫科大學第二附屬醫院血液科確診的DLBCL患者16例，其中DLBCL初診(newly diagnosed，ND)患者6例，男4例，女2例，年齡46～69(56.67±10.40)歲；完全緩解(complete remission，CR)的DLBCL患者4例，男3例，女1例，年齡33～53(45.75±9.22)歲；復發/難治(relapsed/refractory，r/r)的DLBCL患者6例，男4例，女2例，年齡46～85(61.83±13.29)歲，反應性淋巴結增生患者4例，男1例，女3例，年齡31～63(48.00±13.52)歲，性別及年齡差異均無統計學意義(

P

>0.05)。DLBCL患者的診斷及療效評估均依據《中國彌漫大B細胞淋巴瘤診斷與治療指南》(2013年版)判定。

1.2.2

淋巴結組織HE染色 淋巴結組織由多聚甲醛固定后酒精梯度脫水，后在二甲苯中進行透明化處理，經浸蠟、包埋、切片、脫蠟與染色、漂洗、復染和封藏等一系列常規處理后，制作組織切片。光學顯微鏡下觀察淋巴結組織形態特點。

1.2.3

淋巴結組織β

-

半乳糖苷酶染色 將淋巴結組織置于手工研磨器中，加入2 ml PBS溶液充分研磨，研磨完畢后過濾取上清液，用PBS洗滌1次，加入1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min后離心吸除細胞固定液，用PBS洗滌細胞3次后吸除PBS，加入適當量的染色工作液，37 ℃、無二氧化碳、避光條件下染色過夜。普通光學顯微鏡下觀察各組藍染細胞數。

1.2.4

外周血單個核細胞形態學觀察及β

-

半乳糖苷酶染色 收集患者外周血5 ml，經等體積生理鹽水稀釋后緩慢加入淋巴細胞分離液中，離心，收集中間白膜狀細胞層，經生理鹽水洗滌后，離心去除上清液，留取細胞沉淀，于倒置顯微鏡下觀察細胞的大小和形態，用細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒進行衰老檢測，具體方法為：用PBS洗滌1次，加入染色固定液室溫固定15 min后離心吸除細胞固定液，用PBS洗滌細胞3次后吸除PBS，加入適當量的染色工作液，37 ℃、無二氧化碳、避光條件下染色過夜。普通光學顯微鏡下觀察藍染細胞數。

1.2.5

ELISA檢測患者血清中白細胞介素(interleukin, IL)-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-35、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)含量 取患者外周血于抗凝管內，3 000 r/min 離心10 min，分裝血清，-80 ℃保存備用。按照ELISA試劑盒說明書檢測患者血清中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-35、TGF-β1含量。

1.2.6

DOX構建LY8細胞衰老模型 將DOX以雙蒸水配制成10 mmol/L儲存液，再用含2% FBS的RPMI-1640稀釋至最終濃度為10、20和40 nmol/L，DOX處理組分別用10、20或40 nmol/L DOX體外誘導LY8細胞2 h，誘導2 h結束后更換正常含10% FBS的RPMI-1640培養基，隔天誘導一次，共誘導6次。對照組依照同樣頻次和方式，以含2% FBS的RPMI-1640處理6次。

1.2.7

細胞衰老β

-

半乳糖苷酶染色 離心收集上述對照組及各濃度DOX誘導組細胞至1.5 ml離心管內，用PBS洗滌1次，加入染色固定液，室溫固定15 min后離心吸除細胞固定液，用PBS洗滌細胞3次后吸除PBS，加入適當量的染色工作液，37 ℃、無二氧化碳、避光條件下染色過夜。普通光學顯微鏡下觀察各組藍染細胞數。

1.2.8

細胞增殖檢測 取上述對照組及各濃度DOX誘導組細胞，按5 000個細胞/孔的密度接種在96孔板中，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后上機檢測450 nm各孔吸光度值(optical density,OD)。同時設置空白孔，且每組設立5個復孔。

1.2.9

細胞凋亡檢測 DOX誘導細胞衰老6代結束更換正常培養基后24 h，收集懸浮細胞于流式檢測管中，1 500 r/min，離心5 min，加入預冷PBS 500 μl洗滌細胞2次，加入100 μl Binding Buffer懸浮細胞，細胞濃度約為1×10個/ml，再按照Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒說明書使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.10

ELISA檢測各組細胞培養上清液中細胞因子含量 通過離心去除沉淀收集各組細胞培養上清液，-80 ℃保存備用。按照ELISA試劑盒說明書檢測上述各組細胞培養上清液中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-35、TGF-β1含量。

2 結果

2.1 淋巴結組織HE 染色及衰老染色情況

各組淋巴結組織HE染色結果顯示，淋巴結反應性增生組織中，可見大量淋巴細胞增生，未見異形細胞，r/r組DLBCL患者淋巴結組織中可見瘤細胞明顯增大，空泡增多，細胞核呈卵圓形，胞質淡染均勻，符合衰老細胞特征。見圖1。各組淋巴結組織制成的細胞懸液β-半乳糖苷酶衰老染色結果顯示，r/r組DLBCL患者淋巴結組織中可見大量藍綠色細胞，而反應性增生淋巴結組織中未見明顯陽性細胞。見圖2。

圖1 各組淋巴結組織HE染色A：淋巴結反應性增生組 ×100；B：淋巴結反應性增生組 ×400；C:r/r DLBCL組 ×100；D：r/r DLBCL組 ×400

圖2 各組淋巴結組織β-半乳糖苷酶染色A：淋巴結反應性增生組 ×100；B：淋巴結反應性增生組 ×400；C：r/r DLBCL組×100；D：r/r DLBCL組 ×400

2.2 外周血中細胞衰老染色情況

對DLBCL患者外周血單個核細胞形態學觀察及β-半乳糖苷酶染色結果顯示：DLBCL患者外周血中有淋巴瘤細胞浸潤；同時與ND組DLBCL患者比較，r/r組DLBCL患者外周血中的衰老細胞明顯增多。見圖3。

圖3 DLBCL患者外周血單個核細胞形態學觀察和β-半乳糖苷酶染色情況 ×400A：ND組DLBCL患者外周血單個核細胞形態學觀察；B、C：r/r組DLBCL患者外周血單個核細胞形態學觀察；D：ND組DLBCL患者外周血單個核細胞β-半乳糖苷酶染色情況；E、F：r/r組DLBCL患者外周血單個核細胞β-半乳糖苷酶染色情況

2.3 各組DLBCL患者血清中衰老相關細胞因子表達情況

應用ELISA試劑盒對ND、CR、r/r三組DLBCL患者血清中的細胞因子進行檢測，結果顯示，與CR組比較，r/r組患者血清中IL-6、IL-8、IL-10、IL-35、TGF-β1的含量均升高；與CR組比較，ND組患者血清中IL-6、IL-10、IL-35、TGF-β1的含量升高；與ND組比較，r/r組患者血清中IL-2、IL-6、IL-8含量均升高。見圖4。

圖4 各組DLBCL患者血清細胞因子比較A：IL-2；B：IL-6；C：IL-8；D：IL-10；E：IL-35；F：TGF-β1；與ND組比較：*P<0.05

2.4 DOX誘導LY8細胞衰老

對照組細胞形態均一且未見衰老細胞，與對照組比較，DOX干預明顯影響了細胞的生長，衰老的LY8細胞具有擴大的核，不規則的形狀和生長團塊，且隨著DOX濃度的升高，LY8細胞中β-半乳糖苷酶陽性細胞比例也隨之升高。見圖5。

圖5 各濃度DOX誘導衰老的LY8細胞SA-β-gal染色 ×400A：對照組；B：10 nmol/L DOX組；C：20 nmol/L DOX組；D：40 nmol/L DOX組；E：各濃度DOX誘導組β-半乳糖苷酶染色陽性細胞比例

2.5 DOX誘導LY8細胞衰老對細胞功能的影響

與對照組比較，經DOX誘導衰老后的LY8細胞凋亡率增高，40 nmol/L DOX組LY8細胞凋亡率高于對照組差異有統計學意義(

P

<0.01)；在DOX誘導組中隨著DOX濃度的升高，LY8細胞的凋亡率逐漸降低，40 nmol/L DOX組LY8細胞凋亡率低于10 nmol/L DOX組，差異有統計學意義(

P

<0.01)。見圖6。同時，為了進一步探討DOX對LY8細胞的增殖能力的影響，分別對對照組及各濃度DOX誘導組LY8細胞進行CCK-8檢測，結果顯示，四組細胞的增殖率差異有統計學意義(χ=16.969，

P

<0.01)，與對照組比較，經DOX誘導衰老后的LY8細胞增殖率降低，40 nmol/L DOX組LY8細胞增殖率低于對照組，差異有統計學意義(

P

<0.01)；在DOX誘導組中，隨著DOX濃度的升高,LY8細胞的增殖率逐漸增高，40 nmol/L DOX組LY8細胞增殖率高于10 nmol/L DOX組，差異有統計學意義(

P

<0.01)。見圖7。

圖6 流式檢測各濃度DOX誘導LY8細胞的凋亡a：對照組；b：10 nmol/L DOX組；c：20 nmol/L DOX組；d：40 nmol/L DOX組；與對照組比較：**P<0.01；與10 nmol/L DOX組比較：##P<0.01

圖7 CCK-8檢測各濃度DOX誘導衰老對LY8細胞增殖率的影響a：對照組；b：10 nmol/L DOX組；c：20 nmol/L DOX組；d：40 nmol/L DOX組；與對照組比較：**P<0.01；與10 nmol/L DOX組比較：##P<0.01

2.6 各濃度DOX誘導后的LY8細胞衰老相關細胞因子分泌情況

應用ELISA試劑盒對各組LY8細胞分泌的細胞因子進行檢測，結果顯示，各組IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β1分泌量差異有統計學意義(

F

=6.442、24.986、138.517、494.126、34.847，

P

=0.016、0.000、0.000、0.000、0.000)。與對照組比較，40 nmol/L DOX組IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-35、TGF-β1分泌量增高，其中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10分泌量差異有統計學意義(

P

<0.05)；與10 nmol/L DOX組比較，40 nmol/L DOX組，IL-2、IL-6、IL-8、IL-35分泌量增高，其中IL-6、IL-8分泌量差異有統計學意義(

P

<0.05)。見圖8。

圖8 各濃度DOX誘導后LY8細胞分泌細胞因子比較A：IL-2；B：IL-6；C：IL-8；D：IL-10；E：IL-35；F：TGF-β1；a：對照組；b：10 nmol/L DOX組；c：20 nmol/L DOX組；d：40 nmol/L DOX組；與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01；與10 nmol/L DOX組比較：#P<0.05，##P<0.01；與20 nmol/L DOX組比較：△P<0.05,△△P<0.01

3 討論

近年來，腫瘤微環境對于癌癥發病機制和患者生存的影響受到了廣泛關注，在DLBCL中，腫瘤微環境成分影響淋巴樣克隆進展和DLBCL患者的預后，這種影響基于腫瘤細胞與基質成分，細胞外基質、炎性細胞和免疫細胞之間的相互作用。盡管周期停滯是細胞衰老的典型特征，但是衰老對微環境的影響是巨大的。過去認為衰老是防御腫瘤無限增殖的重要屏障，但越來越多的研究顯示，衰老也可以促進腫瘤進展。衰老細胞分泌的生長因子、細胞因子和蛋白酶等構成的衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)能夠引起周圍免疫微環境的廣泛應答，并且與衰老誘導劑的形式，經歷衰老的細胞類型，衰老的腫瘤細胞所處階段緊密相關。衰老通過誘導腫瘤發生，免疫抑制，化學耐藥性和轉移而促進腫瘤進展。SASP最致瘤的作用之一是促進上皮細胞的增殖。目前在淋巴瘤中，僅有IL-6是較為公認的SASP因子，而在本研究中，DLBCL中SASP因子包括IL-6、IL-8、IL-10、IL-35、TGF-β1，在r/r組DLBCL患者中和體外DLBCL衰老模型中均呈現不同程度的上調。同時，體外使用DOX反復誘導的衰老DLBCL細胞具有更強的抗凋亡能力，這可能是衰老參與淋巴瘤復發的重要因素之一。化療應激誘導的衰老DLBCL細胞在體內或體外均可促進各種促炎和免疫抑制性細胞因子分泌，形成獨特的SASP。這種獨特的SASP在機體對抗DLBCL免疫應答中起負性調控作用，誘導DLBCL細胞凋亡抵抗。

綜上所述，本研究結果初步提示細胞衰老通過誘導抑制性細胞因子累積促進DLBCL細胞凋亡抵抗，這項研究仍有一些局限性。首先，由于臨床病例有限，未進一步比較不同階段和類型患者的衰老細胞比例和SASP水平；其次，在體外僅使用LY8細胞進行實驗，該DLBCL細胞系OCI-LY8起源于生發中心型，不能代表非生發中心型來源；同時，細胞衰老促進DLBCL細胞凋亡抵抗在分子水平上的確切機制仍有待進一步研究。