白術芍藥散作用靶點及分子機制的網絡藥理學研究

陸麗娟，史 敏（通訊作者）

（1蘇州大學附屬兒童醫院藥劑科 江蘇 蘇州 215003）

（2南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院<蘇州市吳門醫派研究院中藥臨床藥學實驗室> 江蘇 蘇州 215009）

白術芍藥散由白術、白芍、陳皮、防風4味藥組成，因其治療腹痛泄瀉效果較好又得名“痛瀉要方”，具有補脾柔肝，調和氣機，祛濕止瀉之功效[1]。臨床常用來治療各種原因導致的腹瀉、腸炎等消化系統疾病。現代藥理學發現白術芍藥散有鎮痛、抗炎、止瀉、抗腫瘤等作用。網絡藥理學從中藥多成分、多靶標、多途徑方面闡釋藥物作用機制，有助于在系統層次和分子水平揭示藥效物質基礎與作用機理[2]。本文基于網絡藥理學方法對白術芍藥散藥物作用機制進行分析。

1.方法

1.1 篩選化學成分并預測靶蛋白

借助中藥系統藥理學數據庫TCMSP Version: 2.3，分別以“白術、白芍、陳皮、防風”為關鍵詞，得到化合物白術55種，白芍85種，陳皮63種，防風173種。以生物利用度（OB）和類藥性（DL）為篩選閾值得到候選化合物。基于TCMSP服務器預測其潛在靶點，同時使用蛋白質數據庫，獲得相關靶點蛋白信息。

1.2 構建化合物-靶點及蛋白相互作用（PPI）網絡

為了進一步分析靶點蛋白在整體水平上的作用，將1.1中得到的120個基因上傳至STRING11.0（https://string-db.org/）數據庫。物種設為“人”，最低相互作用選擇confidence≥0.7，其余參數保持默認設置。將互作關系數據導入Cytoscape3.2.1軟件，利用Cytohubba插件獲得度值前5的關鍵靶點蛋白作進一步分析，靶點的度值表示相互作用的靶點個數。

1.3 GO-BP和KEGG通路富集分析

本研究采用David 6.8數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對靶點蛋白進行GO-BP富集分析和KEGG通路富集分析。以“P＜0.01，基因數大于13”作為篩選條件，得到白術芍藥散靶點主要的生物功能及可能性較大的信號通路，并且利用R軟件對GO-BP富集分析中的GO條目和KEGG通路繪制氣泡圖。

2.結果

2.1 獲取候選化合物及靶點

根據1.1篩選條件共得到的40種化合物。其中MOL000358為防風、白芍共有成分，MOL000359為防風、陳皮、白芍共有成分。通過TCMSP服務器預測靶點可獲得33種化合物與其匹配的120個靶點蛋白。

2.2 構建化合物-靶點網絡及PPI網絡圖

網絡圖中每條邊表示方藥與化合物、化合物與靶點之間的相互作用關系。節點的度（Degree）表示網絡中和節點相連路線的條數，隨著度值增大，節點的形狀變大。構建化合物-靶點網絡見圖A，化合物-靶點網絡圖共包括153個節點（33種化合物、120個靶點）和489條邊。白術中度值較高的化合物為MOL000049（3β-乙酰氧基蒼術酮，度=21），MOL000072（8β-乙氧基蒼術內酯Ⅲ，度=13），白芍中度值較高的化合物為MOL000422（山奈酚，度=56）、MOL000358（β-谷甾醇，度=53）；防風中度值較高的化合物為MOL000173（漢黃芩素，度=37）；此外陳皮中的MOL004328（柚皮素，度=38），MOL005828（川陳皮素，度=35）。由此可以推測出這些度值高的化合物可能是白術芍藥散中的核心藥效物質。另外在120個靶點中，有61個靶點與1個活性成分連接，有59個靶點與2個以上活性成分連接。33種活性成分都至少與2個作用靶點相連接，提示白術芍藥散作用于生物網絡具有多成分、多靶點的復雜性。

將120個靶蛋白對應的基因輸入STRING數據庫獲取PPI網絡并將獲得的數據導入Cytoscape3.2.1軟件中，得到120個節點和1 305條邊，見圖B。用cytohubba插件基于degree算法篩選出得分前5的蛋白作為Hub蛋白。這5個Hub蛋白分別為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1），白介素-6（interleukin-6，IL6），絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3），腫瘤抑制因子p53（tumor protein p53，TP53），轉錄因子激活蛋白1（transcription factor AP-1，JUN），分別聯系72、65、62、60、55個蛋白。

圖1 白術芍藥散靶點網絡圖、生物過程及通路分析氣泡圖

2.3 GO-BP生物過程和KEGG信號通路富集分析

本研究從GO-BP富集分析定位白術芍藥散靶點蛋白最主要的生物學過程。GO-BP富集分析獲得428個條目，下載DAVID BP富集結果，分析PValue值。具有顯著意義的（P＜0.01）條目有176條（PValue＜0.0095），從中篩選基因數目大于13個基因的條目，共得到11條富集條目見圖C。參與對藥物的應答、信號轉導、轉錄調節、增殖凋亡、衰老和氧化還原等生物過程。KEGG通路富集分析共獲得127條通路，下載DAVID KEGG富集結果，分析PValue值具有顯著意義（P＜0.01）的有91條，其中基因數目大于13的通路共18條（PValue＜0.0021）見圖D。涉及結直腸癌、前列腺癌等腫瘤信號通路、神經活性配體-受體相互作用通路、PI3K-AKT以及cAMP、TNF、肺結核、肝炎等信號通路。通路上的所含的靶點基因越多，白術芍藥散越有可能通過這些通路發揮作用。

3.討論

本文采用網絡藥理學的方法通過構建化學成分、靶點、疾病網絡，并對靶點的生物功能及通路進行富集分析。方藥中化合物3β-乙酰氧基蒼術酮、8β-乙氧基蒼術內酯Ⅲ、山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素、漢黃芩素、川陳皮素能匹配到較多靶點，可能是方藥發揮藥效的關鍵物質基礎。

由PPI網絡發現AKT1、IL6、MAPK3、TP53、JUN等是白術芍藥散的主要靶點蛋白。AKT1是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞生長代謝、增殖凋亡及轉錄調控等多種生物學過程，研究發現通過靶向AKT1抑制腎癌癌細胞的增殖和遷移[3]。IL6是一種細胞炎性因子，參與細胞的免疫調節。馬智聰發現IL-6在克羅恩病患者腸黏膜組織的炎性反應損傷過程中發揮了重要作用[4]。王凱等人發現加味白術芍藥散可以降低潰瘍性結腸炎患者IL-6、TNF等炎性因子的水平，同時可以改善患者的免疫功能[5]。TP53是一種抑癌基因，其突變在腫瘤發生發展中的功能作用已被廣泛研究。結直腸癌是一種實體瘤，該基因突變是其推動腺瘤向腺癌轉化的關鍵步驟，同時與不良預后和化療耐藥相關[6]。JUN作為細胞轉錄相關蛋白，對細胞增殖，細胞存活與細胞凋亡等重要生理過程具有調控作用。NO的釋放是由NOS3所調控，NOS3基因多態性與肺動脈高壓有關[7]。這些關鍵靶點蛋白為白術芍藥散治療相關疾病提供依據。

通過對靶基因的富集分析發現，白術芍藥散涉及多種生物過程及信號通路與多種腫瘤疾病相關，如口腔癌、乳腺癌、結直腸癌等。除山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素具有抗腫瘤作用外，漢黃芩素通過調控PI3K/AKT、MAPKs等多條信號通路作用于腫瘤細胞生成的各個過程[8-9]。川陳皮素通過抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲、及調節癌細胞周期和蛋白表達多個環節，對前列腺癌、乳腺癌、結腸癌等也具有極強的抗腫瘤活性[10]。因此方藥中的有效成分可能通過腫瘤信號通路上的TP53、AKT1、CASP3及ESR1等靶點抑制腫瘤發生發展的各個環節發揮協同抗腫瘤的作用，但目前白術芍藥散治療腫瘤性疾病臨床應用報道極少。因此，白術芍藥散抗腫瘤可以作為未來研究方向有待進一步驗證。