流體剪切力通過Piezo1調控MG-63骨肉瘤細胞的凋亡

馬宏武，馬成華，張宇，李培武

1.蘭州大學第二醫院急救中心，甘肅蘭州730000；2.蘭州大學第二醫院急診外科，甘肅蘭州730000

前言

骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是最常見的惡性骨腫瘤，發病人群以兒童和青少年居多，通常表現為長骨干骺端的實體瘤［1］。盡管OS 的發生率較低，約為每年每百萬人4.4 例，但它仍是與癌癥相關兒童死亡的最常見原因之一［2-3］。當前的療法包括外科手術和全身化療，手術以切除病灶為主，常造成肢體缺損，嚴重影響患者的心理健康和生活質量。盡管化學療法增加了局部OS 的總體生存率，但生存率仍然較低，約為50%～60%［4］，只有30%的轉移性OS 患者可以實現長期生存，且因耐藥問題日益突出，在過去30～40年中OS生存率無明顯提升［5］。因此，研究OS發展的相關機制和信號通路，尋找潛在的分子靶點對提升OS患者的生存期和生活質量至關重要。

機械敏感（Mechanosensitive,MS）離子通道是完整的膜蛋白，在活細胞的機械信號轉導過程中起著至關重要的作用［6］。最近，Coste 等［7-8］發現了一種新型的MS 陽離子通道，即Piezo1 蛋白，之后又通過同源性序列發現了Piezo2，這兩種MS 陽離子通道分別由FAM38A 和FAM38B 基因編碼。它們是與細胞骨架密切相關的參與機械信號轉導的陽離子通道蛋白，是進化過程中保守離子通道家族的一部分。Piezo1和Piezo2都在空腔器官的組織中廣泛表達，例如胃、肺、膀胱、腸和血管內皮細胞［9］。MS 離子通道功能異常會導致多種遺傳疾病的發生，Piezo1的敲除會致死小鼠胚胎［10］，其功能獲得性突變會導致遺傳性干細胞增多癥［11-12］，而功能喪失性突變會導致淋巴發育不良［13-14］。最近的研究發現Piezo1 在OS 細胞中高表達，在給予拉伸應力后OS 細胞的Piezo1 蛋白表達水平高于對照組，且會促進凋亡蛋白Bax、BAD、caspase 3 和caspase 9 的表達，提示Piezo1 會促進OS細胞的凋亡［15］。

流體剪切力（Fluid Shear Stress,FSS）是骨骼組織中常見的機械應力，它可由肌肉收縮擠壓間質液流經哈弗氏管及骨骼陷窩表面的細胞而產生［16］。在腫瘤微環境中OS 細胞同樣會受到間質液的刺激而產生FSS［17］。最近的研究表明，0.5～12.0 dyn/cm2的FSS可以誘導MG-63 人骨肉瘤細胞的凋亡［18］。Sagar 也報道了高FSS（60 dyn/cm2）消除的腫瘤細胞多于低FSS（15 dyn/cm2），而高FSS 可以在4 h 內消除90%以上的腫瘤細胞，FSS 終止后16～24 h，腫瘤細胞的凋亡仍持續［19］?？梢奆SS 會通過相關信號通路調控OS細胞的凋亡。

綜上所述，Piezo1可調控OS細胞的凋亡，而作為Piezo1離子通道機械刺激之一的FSS 也可促進OS細胞凋亡，因此，我們認為FSS 可通過上調OS 細胞Piezo1 的表達，進而促進OS 細胞的凋亡。為了驗證這一科學假設，我們將給OS 細胞加載60 min 12 dyn/cm2的FSS，檢測Piezo1 的表達情況，以及使用Piezo1的抑制劑GsMTx4 進而明確FSS 是否可通過Piezo1調控OS細胞的凋亡。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

實驗細胞：MG-63 人骨肉瘤細胞購自中國科學院細胞庫。實驗試劑：α-MEM 培養基（Hyclone，美國）、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS結晶粉末（北京中衫金橋，中國）、RIPA 裂解液、PMSF、甘氨酸、十二烷基硫酸納、10% SDS、APS、TEMED、Marker、30%丙烯酰胺、Tris pH=8.8、Tris pH=6.8、BCA 試劑盒、4×上樣緩沖液、PVDF 膜、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、10×TBST Beta-actin 一抗（Abcam, 英國）、caspase3 一抗（Abcam, 英國）、caspase9 一抗（Abcam, 英國）、BAD 一抗（Abcam, 英國）、Bax 一抗（Abcam, 英國）、Piezo1 一抗（Abcam, 英國）、山羊抗鼠二抗（Abcam,英國）、山羊抗兔二抗（Abcam,英國）、ECL 化學發光液。主要儀器如下：生物安全柜（BIOBASE,中國）、細胞培養箱（Thermo, 美國）、超高速離心機、磁力攪拌器、顯微鏡、冰箱（海爾, 中國）、制冰機（雪科,中國）。

1.2 細胞培養

將購買的MG-63 細胞解凍后吸出置于細胞培養瓶中，再加入4 mL 由α-MEM 培養基、10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素制成的完全培養基，吹打混勻后放入37 ℃、5%濃度二氧化碳的細胞培養箱中培養，每3 d 換液一次。待細胞長滿瓶底90%的區域時可進行細胞傳代與凍存。

1.3 細胞爬片

在培養皿中不同區域滴入兩滴培養基后將消毒的蓋玻片放于培養基上（用于固定蓋玻片），將消化好的細胞懸液向每個玻片上滴加600 μL（注意不要滴到玻片以外的皿底區域），平穩置于培養箱中培養，3 h后待細胞完全貼于玻片上時再小心向各玻片上滴加5 mL培養基，再置于培養箱中培養，等待加載FSS。

1.4 加載FSS

第一部分實驗分組為Control 組和FSS 組，將兩組細胞玻片從皿底小心取出置于FSS 加載裝置流體小室中，組裝好管路后，向儲液罐中加入300 mL培養基，設定FSS 大小為12 dyn/cm2，加載時長為60 min，啟動裝置開始加載FSS。第二部分實驗分組為Control組、FSS 組、GsMTx4 組和FSS+GsMTx4 組，其中GsMTx4 組的細胞在加載FSS 前使用10 μmmol/L的Piezo1 的抑制劑GsMTx4 處理，FSS+GsMTx4 組的細胞使用10 μmmol/L 的Piezo1 的抑制劑GsMTx4 處理后加載FSS，FSS 的大小和加載時間與第一部分相同。

1.5 Western Blot檢測

FSS 加載完畢后，使用預冷PBS 洗滌玻片3 次，向玻片上加入配制好的裂解液在冰上裂解，用刮刀刮玻片收集裂解液，在12 000 rpm的超高速離心機中離心20 min 后取上清，標記好樣本名和體積后使用BCA 試劑盒測定各組的蛋白濃度以確定上樣量，再加入上樣緩沖液，置于沸水中煮5 min，置于冰箱中備用。配膠、制膠后按照各組蛋白上樣量向孔中加入樣本，電泳結束后，使用PVDF膜進行轉膜，電轉結束后封閉液封閉1 h，再使用一抗搖床孵育1 h 后過夜，10×TBST洗滌后二抗孵育1 h，再次洗滌后曝光。

1.6 統計學分析

使用SPSS20 軟件進行數據分析，所有實驗數據均重復3 次，計量資料以均數±標準差表示，使用t檢驗和單因素方差分析進行統計分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FSS促進MG-63細胞的凋亡

對FSS 組的MG-63 細胞加載60 min 12 dyn/cm2的FSS 后檢測兩組（Control 組和FSS 組）凋亡蛋白caspase3 的表達情況。Western Blot 檢測結果見圖1a。如圖1b所示，FSS 組的caspase3蛋白表達水平顯著高于對照組（P＜0.001），這說明FSS 可促進MG-63細胞的凋亡。

2.2 FSS促進MG-63細胞Piezo1的表達

使用Western Blot 檢測兩組Piezo1 的表達情況，結果見圖1a。如圖1c 所示，FSS 組Piezo1 的表達水平較Control 組顯著升高（P＜0.001），提示FSS 可上調MG-63 細胞機械敏感離子通道Piezo1 的表達，這與FSS調控caspase3的表達呈同向變化。

圖1 Western Blot檢測FSS組和Control組的caspase3和Piezo1的表達情況（***P＜0.001）Fig.1 Expression levels of caspase3 and Piezo1 in FSS group and control group detected by Western Blot(***P＜0.001)

2.3 FSS通過Piezo1促進MG-63細胞的凋亡

為了明確FSS 是否可通過Piezo1 離子通道調控MG-63 細胞的凋亡，實驗分組分為Control 組、FSS組、GsMTx4 組和FSS+GsMTx4 組，依次給予各組對應的干預措施后檢測凋亡相關蛋白caspase3、caspase9、BAD 和Bax 的表達。Western Blot 結果見圖2a。如圖2b 所示，FSS 組的caspase3 較Control 組顯著升高（P＜0.001），而FSS+GsMTx4 組的caspase3較FSS 組顯著降低（P＜0.001），這表明FSS 可通過Piezo1 上調caspase3 的表達。如圖2c 所示，FSS 組caspase9 的表達較Control組顯著提高，FSS+GsMTx4組的caspase9較FSS組顯著下降（P＜0.001），說明FSS可通過Piezo1 促進MG-63 細胞caspase9 的表達。如圖2d 所示，FSS 顯著提高了MG-63 細胞凋亡蛋白BAD 的表達（P＜0.001），FSS+GsMTx4 顯著抑制了凋亡蛋白BAD 的表達（P＜0.001），提示FSS 可通過Piezo1促進MG-63細胞凋亡蛋白BAD的表達。如圖2e 所示，FSS 組的Bax 表達水平較Control 組明顯升高（P＜0.001），FSS+GsMTx4 組Bax 表達水平較FSS組明顯下降，說明FSS是通過上調Piezo1離子通道的表達來提高Bax 的表達水平。綜上所述，FSS 可通過上調Piezo1 機械敏感離子通道的表達來上調凋亡相關蛋白的表達，進而促進MG-63細胞的凋亡。

圖2 Western Blot檢測Control組、FSS組、GsMTx4組和FSS+GsMTx4組凋亡相關蛋白的表達情況（***P＜0.001）Fig.2 Expression levels of apoptosis-related proteins in control group,FSS group,GsMTx4 group and FSS+GsMTx4 group detected by Western Blot(***P＜0.001)

3 討論

Piezo1 離子通道是一種新型的機械敏感離子通道，目前的研究大都集中在Piezo1蛋白的結構解析方面。本研究首次闡述了FSS 通過Piezo1 調控MG-63人骨肉瘤細胞的凋亡，實驗過程中，我們使用了Piezo1 的特異性抑制劑GsMTx4，確保在抑制Piezo1離子通道的同時不影響其他離子通道，相關蛋白在FSS 組和FSS+GsMTx4 組的表達差異足以說明FSS是通過Piezo1而非其他離子通道發揮作用，最終的結果表明FSS可上調機械敏感離子通道Piezo1的表達，進而上調凋亡相關蛋白caspase3、caspase9、BAD 和Bax的表達，促進MG-63細胞的凋亡。

在腫瘤微環境中，間質液會流經OS 細胞表面產生FSS，FSS 的機械信號會經細胞膜和細胞內的信號傳導抵達相關效應靶點，進而引起相應的細胞反應［20-22］。FSS 可通過激活ERK5-AKT-FoxO3a 信號通路下調FasL 和Bim 的表達進而抑制caspase3 的激活，抑制成骨細胞的凋亡［16］。FSS不僅與成骨細胞的凋亡相關，最新的研究發現，FSS 可上調Hep3B 肝癌細胞、MG63 骨肉瘤細胞、SCC25 口腔鱗狀細胞癌和A549 癌性肺泡基底膜上皮細胞caspase3、caspase8 和caspase9的表達并促進這些細胞的凋亡［23-24］。這說明FSS與腫瘤細胞的凋亡密切相關，本實驗中我們發現FSS 可促進caspase3、caspase9、BAD 和Bax 等凋亡相關蛋白的表達，促進MG-63 細胞的凋亡。有意思的是，Bin等［16］研究提示FSS抑制了caspase3的表達，這與本研究的結果截然相反，這可能是細胞種系、細胞狀態和加載的FSS 大小時間不同所致。最近有研究關注了FSS 將機械信號傳遞至細胞內的機制，發現FSS 激活ERK 呈雙相，早期階段不依賴于Ca2+、PI3-K和Rho激酶，但需要RAF活性，而后期卻依賴于Ca2+，不依賴RAF 活性［25］。這說明FSS 作用于細胞產生特定的細胞反應依賴于Ca2+，而Ca2+是通過相關離子通道進入細胞的。本研究中我們所關注的Piezo1 機械敏感離子通道就是一種陽離子通道，可允許包括Ca2+在內的許多陽離子進入細胞，引起膜電位的變化，進而引起特定的細胞反應［26-27］。最近，有研究發現Piezo1 在人OS 細胞中高表達，給予拉伸應力后Piezo1在MG-63和U2OS細胞系的表達水平會明顯升高，且凋亡相關蛋白Bax、BAD、caspase3和caspase9的表達也隨之升高［15］，可見這種拉伸應力可增加Piezo1機械敏感離子通道的數量，促進更多的陽離子進入細胞，引起細胞的凋亡。本研究加載的外力是OS 微環境中最常見的FSS，它也是通過增加Piezo1機械敏感離子通道的數量，進而促進MG-63 細胞凋亡的。除了外力不同，我們的研究僅納入了MG-63 這一種細胞系，而沒有研究U2OS 和143B 等細胞系，但研究結論高度一致。這也從側面證實了細胞外應力的確可促進OS細胞的凋亡。

本研究揭示了Piezo1 機械敏感離子通道是一個治療OS的潛在靶點。臨床中我們無法掌控FSS的大小，也無法通過某種設備將其應用于OS 患者，但是我們可以促進肌肉活動以上調OS 細胞表面Piezo1機械敏感離子通道的數量，進而促進OS 細胞的凋亡。此外，通過Piezo1這一分子靶點研發新的藥物可為臨床治療OS提供一種全新的選擇。

本研究首次證實FSS 可通過Piezo1 機械敏感離子通道調控MG-3骨肉瘤細胞的凋亡。3這一種骨肉瘤細胞，而沒有納入U2OS 和143B 等細胞系，研究結論的可靠性有待驗證。僅使用抑制劑GsMTx4 來阻斷Piezo1 機械敏感離子通道，而沒有使用小干擾RNA 沉默Piezo1 的表達，這可能影響實驗結果的準確性。此外，僅采用Western Blot 這一實驗手段進行細胞凋亡的檢測，而沒有采用流式細胞儀和TUNEL法分析細胞的凋亡。

綜上所述，FSS 可通過Piezo1 機械敏感離子通道促進MG-63 人骨肉瘤細胞的凋亡，Piezo1 可能是一種治療骨肉瘤的新型分子靶點。