基于網絡藥理學探討心脾同治方治療慢性心力衰竭的作用機制

史勝楠，王培利，劉建勛

慢性心力衰竭是由于心臟結構或功能變化，導致心室泵血或充盈功能低下的一組復雜臨床綜合征，主要表現為呼吸困難、乏力、液體潴留等[1]。2017年慢性心力衰竭全球患病人數超6 430萬人[2]，死亡率居高不下，日漸成為棘手的公共衛生問題。目前，主要以阻斷神經內分泌過度激活和心臟重塑的治療為主，但存在治療靶點單一、毒副作用多、病人依從性差等問題[3]。中醫學認為慢性心力衰竭病位在心，然“五臟皆致心力衰竭，非獨心也”，心脾乃母子相生關系，心之氣血陰陽虧虛，脾失運化，氣血津液運行不暢，導致瘀血、痰濁、水飲等瘀阻心脈而加重病程[4]。母病及子，故心之病，必涉及脾。因此，心脾同治、調補心脾氣血陰陽平衡為治療之重。

心脾同治方是研究團隊基于經典名方當歸補血湯研究基礎，結合臨床實踐總結的經驗方，由生黃芪、當歸、白術、丹參、黃連、紅景天組成，具有益氣活血、養心健脾的功效。課題組前期體內、體外研究證實，黃芪、當歸組方通過激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKt)，提高心肌梗死大鼠心肌細胞內血管內皮生長因子(VEGF)mRNA表達，從而發揮促血管新生作用[5]。益氣藥可抑制心肌細胞外基質過度沉積，減輕心室重構，改善心肌梗死后心功能[6]。為進一步探討心脾同治方治療慢性心力衰竭的作用機制，本研究基于網絡藥理學方法，利用多種相關網絡數據庫，從化合物-靶點-信號通路-疾病多維度進行深入分析。

1 資料與方法

1.1 心脾同治方相關信息的整理和收集 通過中藥系統藥理學技術平臺(TCMSP)數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取心脾同治方六味中藥的化學成分，將口服生物利用度(OB)和類藥性(drug-likeness，DL)作為篩選閾值，設定OB≥30%，DL>0.18。同時匯集化學成分對應的有效靶點，并錄入UniProt數據庫(http://www.uniprot.org/)進行校正、轉化和刪重，最終獲取心脾同治方活性成分的基因靶點。

由于TCMSP數據庫未收錄紅景天，因此在TCMID數據庫(https://bigd.big.ac.cn/databasecommons/database/id/437)中檢索紅景天的化學成分，并將該成分返回TCMSP數據庫，檢索OB和DL值，對未檢索到的成分，通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得該成分的二維結構或SMILE號，并進一步在Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測紅景天成分靶點。

1.2 慢性心力衰竭相關靶點數據構建 基于人類基因數據庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)和美國國家生物技術信息中心數據庫(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=)遴選慢性心力衰竭的靶點，利用Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對比分析藥物、疾病的潛在靶點，篩選出交集靶點。

1.3 心脾同治方與慢性心力衰竭的網絡構建及分析 將交集靶點輸入STRING數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)構建蛋白互作(PPI)圖，并導入Cystoscape 3.6.0軟件中，構建“化合物-靶標-疾病”網絡圖，通過Network Analyzer工具進行拓撲分析，探討心脾同治方活性成分的“多靶標-多通路-多層次”的治療作用。

1.4 生物信息學基因本體(GO)分析及信號通路富集分析 將藥物疾病共有靶點進行GO分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析，引用Metascape數據庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，收集P<0.01，Min Overlap為3且MinEnrichment>1.5 的項目進行篩選，綜合預測心脾同治方治療慢性心力衰竭關鍵靶點的生物學特性及調控通路。

2 結 果

2.1 心脾同治方活性成分篩選 經過檢索篩選并去重，獲得化學成分白術4個、丹參58個、當歸2個、紅景天6個、黃連11個、黃芪20個(雖然黃芪皂苷類不符合ADME篩選標準，已有大量文獻證實黃芪皂苷對治療慢性心力衰竭有明顯的療效[7]，因此將該類成分納入研究)，由于篩選的活性成分較多，故選取部分活性成分，詳見表1。該方成分作用的所有靶點經去重后共499個，使用Cytoscape 3.6.0軟件構建化合物-靶點網絡圖，詳見圖1。Network Analyzer工具進行拓撲分析，得知網絡中有601個節點、2 099個邊，節點度值大小表示重要程度，排名居前10位的化合物及其靶點詳見圖2。其中化合物包括檞皮素、3-辛醇、花色苷、桃金娘烯醇、黃芪皂苷Ⅳ、山柰酚、木樨草素、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ；對應靶點包括PTGS2、SCN5A、PTGS1、ADRB2、CHRM1、RXRA、ADRA1A、NICOA2、AR、ACHE。

圖1 心脾同治方化合物-靶點網絡圖

圖2 節點度值居前10位的化合物及靶點

表1 心脾同治方的主要活性成分

2.2 慢性心力衰竭相關靶點數據構建 以“chronic heart failure”為關鍵詞，在GeneCards數據庫和NCBI基因數據庫中檢索。由于GeneCards數據庫檢索到的基因數量龐大，將relevance值[8]通過中位數篩選3次，共獲得1 234個相關基因。NCBI基因數據庫得到761個基因，合并去重后得到1 560個慢性心力衰竭相關基因。將藥物與疾病的靶點輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1，得到254個交集靶點，作為心脾同治方作用于慢性心力衰竭的預測靶點進行通路富集分析。詳見圖3。

圖3 中藥復方與慢性心力衰竭靶點韋恩圖

2.3 PPI網絡構建及拓撲分析 將交集靶點輸入STRING數據庫，設置研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用評分設置為“highest confidence(0.900)”，隱藏網絡中的單一節點，其余參數保持默認設置，進行PPI網絡的構建，詳見圖4。圖中共涉及254個節點、1 309條邊，平均節點度值為10.3，聚類系數為0.491。將PPI網絡導入Cystoscape 3.6.0軟件中，構建心脾同治方化合物-靶點-疾病網絡圖，詳見圖5。Network Analyzer進行拓撲分析，以自由度(degree)、介數中心性(betweenness centrality)、平均最短路徑長度(average shortest path length)、接近中心性(closeness)作為參考標準，通過degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關鍵靶點，共34個，主要包括信號傳導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶1(Akt1)、c-JUN氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JUN)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)等，將這些靶點作為心脾同治方治療慢性心力衰竭的關鍵靶點。選取居前20個關鍵靶點，詳見圖6。

圖4 中藥-慢性心力衰竭共有靶點PPI網絡圖

圖5 中藥化合物-靶點-慢性心力衰竭網絡圖

圖6 中藥-疾病關鍵靶點(degree值，居前20位)

2.4 生物信息學GO分析 將共有靶點導入Metascape數據庫進行GO富集分析，共富集到7 137條生物過程(biological process，BP)、1 072項分子功能(molecular function，MF)、605項細胞組成(cellular component，CC)。BP主要涉及血液循環、循環系統、MAPK級聯調節、多肽應答、細胞對氮化合物的應答、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、脂多糖應答等方面。CC主要涉及膜筏、溶酶體、囊泡腔、受體復合物等，主要集中在細胞膜和蛋白復合物上。MF主要包括蛋白激酶活性、蛋白質結構域特異性結合、細胞因子受體、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質二聚體活性等方面，根據每個項目P值及基因數繪制條形圖，詳見圖7。

圖7 GO富集分析柱狀圖

2.5 KEGG通路富集分析 將共有靶點導入Metascape數據庫進行KEGG通路富集分析，總共富集到280條信號通路。相關通路涉及糖基化終末產物(AGE)及其受體(RAGE)信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、PI3K/Akt信號通路、白細胞介素-17(IL-17)信號通路、低氧誘導因子1(HIF-1)信號通路、輔助性T細胞17(Th17)分化、TNF信號通路、細胞凋亡等。根據每條項目P值及基因數量繪制氣泡圖，詳見圖8。

圖8 KEGG富集分析氣泡圖

3 討 論

慢性心力衰竭的發病機制與交感神經系統、腎素-血管緊張素-醛固酮系統、炎性因子過度激活有關，脾胃受自主神經的影響，二者均通過不同遞質產生不同的病理變化，同時慢性心力衰竭常合并胃腸瘀血導致脾胃功能紊亂，可見心脾關系密切[9]。心脾同治方中黃芪補益心脾之氣，助心氣推動血液運行，助脾氣化生氣血之源，為君藥；當歸、丹參養血活血，紅景天益氣活血化瘀，《本草綱目》記載：“紅景天，本經上品，祛邪惡氣，補諸不足”，三藥為臣；黃連入中焦，清熱燥濕，祛腸胃之瘀滯，為佐藥。白術苦溫入脾經，燥濕健脾，加強益氣助運之力，同時引諸藥入脾經，為使藥。

本研究運用網絡藥理學方法對心脾同治方成分、靶點與疾病的生物信息學進行綜合分析。心脾同治方化合物靶點網絡中，具有高度中心性的關鍵化合物分子主要來源于黃芪、紅景天、丹參，這3味藥物廣泛用于心血管領域。其中槲皮素、3-辛醇、花色苷、山柰酚均具有較強的抗炎活性[10]。課題組研究發現，檞皮素、山柰酚可抑制核轉錄因子-κB和Akt磷酸化而減少心臟成纖維細胞TNF-α、IL-6及IL-1β炎性因子分泌[11-12]。檞皮素可降低冠心病病人IL-10、TNF-α表達[13]，通過多重信號通路抑制氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)介導的內皮損傷，發揮抗動脈粥樣硬化的作用[14]。木樨草素通過抑制促凝蛋白酶活性、纖維蛋白原與凝血酶之間的相互作用，發揮抗血栓功能[15]。桃金娘烯醇可激活超氧化物歧化酶等內源性抗氧化酶活性，維持促凋亡和抗凋亡途徑(Bax和Bcl-2)平衡，以此減少缺血再灌注后的心肌損傷[16]。黃芪皂苷Ⅳ具有保護心肌缺血、調節肌漿網Ca2+泵、促進血管生成、改善能量代謝、抑制心肌肥厚和纖維化、減少心肌細胞凋亡的作用[17]。化合物靶點自由度較高的前列環素內過氧化物合酶2(PTGS2)是花生四烯酸合成前列環素類(PGs)和血栓素A2(TXA2)的關鍵酶，參與動脈硬化的病理過程，其過度表達導致血管壁炎癥反應，刺激血管平滑肌細胞增殖和遷移[18]。

SCN5A基因編碼Na_v1.5的α亞基，該通道主要控制內向鈉電流，并在調節心臟電生理功能方面發揮關鍵作用，SCN5A表達減少導致小鼠心肌中晚期Na+電流增加，活性氧不斷累積，造成心肌細胞結構紊亂，線粒體損傷和纖維化[19]。MAPK1、MAPK3、MAPK14屬于MAPK家族[20]，通過細胞外信號調節激酶(ERK)、p38蛋白激酶、JNK等多條通路調控細胞凋亡、能量代謝、神經內分泌因子釋放，從而控制炎癥反應，改善心力衰竭[21-22]。由此可見，心脾同治方在抑制炎癥反應方面發揮著重要作用。

通過對交集靶點分析發現，STAT3自由度相對較高，即STAT3在心脾同治方治療慢性心力衰竭過程中具有重要的生物學意義。作為諸多細胞內信號通路的關鍵蛋白，STAT3參與心肌細胞凋亡、心肌能量代謝、心室重構、炎癥反應等病理生理改變[23-24]。關鍵靶點中的炎性因子TNF-α、IL-6與心力衰竭嚴重程度密切相關，可降低左室射血分數，直接損傷心肌纖維，導致心肌收縮功能減退[25]，同時促炎因子激活STAT3發揮作用。

KEGG富集通路主要包括流體剪切應力與動脈粥樣硬化、PI3K/Akt通路、炎性因子相關信號通路、HIF-1信號通路、細胞凋亡等。FSS是血流與血管壁摩擦產生的平行于血管壁的切線應力[26]。有研究顯示，低FSS誘導內皮功能紊亂，促使動脈粥樣硬化的發生及斑塊形成，同時升高一氧化氮合酶3活性和VEGFA表達[27]。細胞凋亡是由基因調控的細胞程序性死亡，有助于維持機體內環境穩定，過度的心肌細胞凋亡導致心肌收縮單位進行性丟失，造成心功能不全[28]。Th17細胞是以分泌IL-17為特征的輔助性淋巴細胞亞群，產生IL-17、IL-6、TNF-α，這些炎性因子激活導致炎癥級聯反應，反之誘導心肌細胞凋亡程序的啟動，加重心力衰竭進程[29]。PI3K/Akt作為重要的信號轉導途徑，其激活作用于下游的TNF-α/核轉錄因子-κB、IL-6/STAT3、Bcl-2/p53等多個靶點，抑制炎癥反應，清除氧自由基，調控線粒體能量生成，維持心肌細胞凋亡機制的動態平衡，進而維持正常心功能[30-31]。缺血性心臟病、心力衰竭的病理生理發展過程中，HIF-1作為轉錄調節因子，通過調節血管生成、血管重塑、維持葡萄糖代謝和氧化還原穩態，發揮重要的保護作用[32]。

綜上所述，心脾同治方通過PI3K、Akt1、MAPK、STAT3、IL-6、TNF-α、VEGFA等關鍵靶點，調控PI3K/Akt通路、HIF-1信號等通路抑制炎癥反應，改善心室重構，減少心肌細胞凋亡，提高心肌能量代謝，為心脾同治方治療慢性心力衰竭的進一步研究提供了依據。